抗VEGFR2全人化单抗的抗血管形成和抗肿瘤作用研究

摘要

肿瘤血管为肿瘤发生、发展提供足够的氧分和营养,靶向肿瘤血管新生可以达到抑制肿瘤生长的作用。血管内皮生长因子(VEGF)是一类能够调节血管生成的因子,它们需与其受体结合从而发挥生物学效应,VEGFR2是转导VEGF血管新生信号的关键受体,参与调控VEGF通路介导的细胞增殖、细胞存活、迁移和血管形成等。并且,VEGFR2不仅在肿瘤相关的内皮细胞上表达,而且还可能在某些肿瘤细胞,尤其是肿瘤干细胞上也高表达,因此选择性地阻断VEGFR2信号通路可以抑制肿瘤血管的形成和肿瘤细胞的生长。基于以上事实,山东步长神州制药有限公司研发了抗VEGFR2全人化单克隆抗体BC001,我们将从体外实验、小鼠肿瘤模型实验探讨药物的抗血管新生和抑制肿瘤生长的作用。
　　首先,我们利用人脐血管内皮细胞(HUVEC)的细胞活性实验、细胞划痕实验,Transwell迁移实验、血管状结构形成实验分别研究BC001对血管内皮细胞的增殖、侵袭、迁移和血管状结构形成的影响,从我们的结果中可以发现 BC001能够抑制血管内皮细胞的血管内皮细胞的增殖、侵袭、迁移和血管状结构形成,说明该抗体药物在体外能够抑制血管的形成。
　　此外,我们查阅文献发现,VEGFR2在肿瘤干细胞上高表达,影响着肿瘤干细胞的活性、自我更新能力、致瘤性,并且提示VEGFR2也参与了肿瘤干细胞向内皮细胞转分化过程,因此我们建立了胶质瘤干细胞向血管内皮细胞转分化模型,研究BC001对胶质瘤干细胞向血管内皮细胞转分化的干预作用。
　　体内实验,我们首先根据概念验证原则(proof-of-concept),完成了抗鼠VEGFR2人源化单克隆抗体对鼠B16F10细胞的皮下移植瘤生长的影响实验,实验结果证实抗鼠VEGFR2人源化单克隆抗体能够很好的抑制B16F10皮下移植瘤的生长。
　　随后我们进行了BC001对人结肠癌HCT116细胞的裸鼠的皮下移植瘤实验,该部分数据显示 BC001可以一定程度的抑制肿瘤生长。并且我们对实验中空白对照组、贝伐珠单抗组和BC00110mg/kg组的瘤块进行HE染色和组织免疫组化(Ki67,Caspase3,TUNEL,CD31,VEGFR2),分别从增殖、凋亡,血管密度和VEGFR2表达量等方面考察BC001对HCT116细胞的皮下移植瘤生长的影响。最后我们还观察到BC001能够明显抑制胃癌细胞BGC823的皮下移植瘤生长。
　　基于以上所有实验结果,我们认为抗VEGFR2全人化单克隆抗体能够抑制肿瘤血管的形成和肿瘤的生长。
　　核黄素是人体新陈代谢酶系统的重要组成部分,参与生物机体的生物氧化反应和能量代谢,与人体内碳水化合物、脂肪及氨基酸代谢也有着密切的关系。但是核黄素在体内储存量小,生物利用度低,半衰期短,极易造成各种核黄素缺乏症。月桂酸核黄素为长效核黄素,它可以在体内缓慢释放出游离的核黄素,发挥长效的药理作用,但是具体明确的月桂酸核黄素在体内转运机制尚未有研究报道。而Caco-2细胞模型已经广泛地被认为是良好的体外模型,来进行药物跨膜转运机制的研究。所以本实验首先建立Caco-2细胞转运模型,考察月桂酸核黄素在Caco-2细胞模型上转运机制,阐明月桂酸核黄素的体内转运方式。通过月桂酸核黄素在Caco-2细胞模型上双向转运实验,我们可以得知,月桂酸核黄素(10,25,50mmol/L)能以原型药物通过Caco-2细胞模型,并且表观渗透系数 Papp在(1.0-10)×10-6之间,说明月桂酸核黄素在体内可以以原型药物被转运,然后发挥药理作用,并且可能是通过主动转运的方式。由于月桂酸核黄素在Caco-2细胞模型上的外排系数EfR在1.5-2.5之间,暗示月桂酸核黄素转运过程中可能存在外排机制。
　　月桂酸核黄素自开发以来,一直被用于治疗因核黄素缺乏引起的各种综合症。最近在临床上,研究者们发现月桂酸核黄素对肿瘤化疗、放疗后引起的口腔和消化道黏膜炎有很好的治疗作用,但其细胞水平上的药效学研究仍未得到证实。本实验选用人肺成纤维细胞(Helf),利用顺铂、60Co-γ照射建立化疗、放疗引起的细胞损伤模型,从而研究月桂酸核黄素对化疗药物、放射造成的细胞损伤的保护及治疗作用。实验结果显示,月桂酸核黄素对化疗或放疗造成的Helf细胞损伤有良好的保护或治疗作用,且与核黄素相比,这种保护或治疗作用更强。

目录

目录

英文缩略词(Abbreviations)

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1． 主要试剂

2. 主要仪器设备

3. 细胞株、实验动物

实验方法

1. 抗VEGFR2全人化单抗的体外抗血管形成作用研究

2. 抗VEGFR2全人化单抗对胶质瘤肿瘤干细胞向血管内皮细胞转分化的影响[14]

3. 抗鼠VEGFR2人源化单抗抑制鼠黑色素瘤细胞B16F10的皮下移植瘤生长[16]

4. 抗VEGFR2全人化单抗抑制人结肠癌细胞HCT116的皮下移植瘤生长

5. 抗VEGFR2全人化单抗抑制人胃癌细胞BGC823的皮下移植瘤生长

6. 实验数据处理

实验结果

1.1 VEGFR2结合实验

1.2 抗VEGFR2全人化单抗能够抑制HUVEC细胞的增殖

1.3 抗VEGFR2全人化单抗对HUVEC细胞划痕实验的影响

1.4 抗VEGFR2全人化单抗对HUVEC细胞Transwell侵袭实验的影响

1.5 抗VEGFR2全人化单抗对HUVEC细胞Matrigel微管状结构形成实验的影响

实验讨论

实验结论

参考文献

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1． 主要细胞和试剂

2. 主要仪器设备

实验方法

1.月桂酸核黄素在Caco-2细胞模型上转运机制研究

2.月桂酸核黄素对肿瘤化疗、放疗过程中口腔和消化道黏膜炎的体外药效研究

3 数据处理

实验结果

1. 月桂酸核黄素在Caco-2细胞模型上转运机制的研究

2.月桂酸核黄素对顺铂、60Co-γ辐射损伤的Helf细胞的治疗作用

实验讨论

实验结论

参考文献

综述

参考文献

致谢

个人简历

在读期间承担的课题：