一种利用朝鲜崖柏嫩茎段试管内生根和生长同步的高效育苗方法

摘要

本发明涉及一种植物繁殖，即一种利用朝鲜崖柏嫩茎段试管内生根和生长同步的高效育苗方法。其生根和茎段同时生长的培养基为：培养基＋ZT(0.06～0.08mg·L

说明书

技术领域　

本发明涉及一种植物繁殖，即一种利用朝鲜崖柏嫩茎段试管内生根和生长同步的高效育苗方法。

背景技术

在现有技术中，朝鲜崖柏（Thuja koraiensis Nakai）别名长白侧柏，柏科崖柏属常绿小乔木或灌木状。具有经济、药用和观赏等价值。是我国国家二级重点保护植物。仅在长白山国家级自然保护区的红土山一带有较大的种群面积，其他区域仅有零星分布。被《中国珍稀濒危保护植物名录（第一册）》定为渐危种，被《中国珍稀濒危保护植物名录（第一批）》定为国家二级重点保护植物。被《中国物种红色名录》定为濒危种(EN)。在《吉林省野生动植物保护管理暂行条例》一文中被定为省级一类重点保护植物。本研究开展的利用朝鲜崖柏嫩茎段试管内生根和生长同步的高效育苗方法的报道国内外迄今未见。

发明内容

本发明的目的是针对朝鲜崖柏野生资源少，扦插、种子等常规方法繁殖消耗野生资源大，生根和发芽困难、移栽成活率低、导致野生资源严重受砍伐、采挖等不足而提供一种技术可行，生根率高的利用朝鲜崖柏嫩茎段试管内生根和生长同步的高效一步育苗方法。

本发明的技术解决方案是：一种利用朝鲜崖柏嫩茎段试管内生根和生长同步的高效育苗方法，其步骤如下：

（1）以朝鲜崖柏枝条水培侧芽嫩茎段作为外植体，其生根和茎段同时生长的培养基为：培养基＋ZT(0.06～0.08 mg·L^-1)＋NAA(0.01～0.03 mg·L^-1)＋IAA(0.02～0.04 mg·L^-1)；培养基中附加琼脂8.0 g·L^-1，蔗糖15 g·L^-1，调节pH值至5.6，嫩茎段在光照周期10 h·d^-1、光照强度900 lx和温度(25±2) ℃条件下培养；

所述的培养基成分和含量是指：412.5 mg·L^-1NH₄NO₃，475 mg·L^-1KNO₃，110 mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，92.5 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，42.5 mg·L^-1KH₂PO₄；4.64 mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，6.22 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；0.083 mg·L^-1KI，0.62 mg·L^-1H₃BO₃，2.23 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，0.86 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，0.025 mg·L^-1Na₂MO₄·2H₂O，0.0025 mg·L^-1CuSO₄·5H₂O，0.0025 mg·L^-1CoCl₂·6H₂O；   

（2）将种苗扩繁后的小植株从培养瓶中取出，放在杀毒矾溶液中洗净根上的琼脂，将小植株栽植到消毒过的草炭土、腐烂松针和河砂 4: 3: 1的基质中，覆盖塑料薄膜进行保湿保温，控制温度为18±2 ℃，保持相对湿度在75%，10 h·d^-1的自然光照。 

本发明的优点是：本发明培养基和方法步骤有利于朝鲜崖柏嫩茎段试管内同时生根和生长，生根率高，可操作性强，从茎段接种到出苗仅用1种低成本培养基，属一步成苗方法，可以满足工厂化育苗的需要。按着38天为一个增殖周期，按每瓶接种10个茎段，每个茎段在一个周期内可切割成（4～6）段计算，每年有n个周期（朝鲜崖柏每年8个周期）进行扩繁，年生产朝鲜崖柏种苗数为：∑年产成活种苗=10×(4～6)ⁿ株，可见其繁殖数量，该方法对利用少量的野生资源材料年繁殖出上百万株的珍稀濒危植物种苗具有重要社会、经济和生态意义，解决了常规扦插等繁殖方法利用大量野生资源，造成野生资源砍伐和灭绝等问题。经统计计算，小植株成活率可达到95.0%以上。

下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。 

具体实施方式

1  材料与方法

1.1 材料及处理

朝鲜崖柏枝条采自通化县石湖镇老岭村，将去除顶尖的枝条进行水培促其侧芽萌发。待侧芽长至2.00 cm时将嫩枝剪下，用75%乙醇（体积分数）涮洗20 s后移至3.0%次氯酸钠溶液(质量浓度)浸泡15 min，无菌水冲洗10次，无菌滤纸吸干表面水分，去除损伤组织后切割成0.5 cm茎段作为外植体备用。

1.2 朝鲜崖柏茎段生根生长、植株高效再生体系建立和炼苗

培养基成分及含量为：412.5 mg·L^-1NH₄NO₃，475 mg·L^-1KNO₃，110 mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，92.5 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，42.5 mg·L^-1KH₂PO₄；4.64 mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，6.22 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；0.083 mg·L^-1KI，0.62 mg·L^-1H₃BO₃，2.23 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，0.86 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，0.025 mg·L^-1Na₂MO₄·2H₂O，0.0025 mg·L^-1CuSO₄·5H₂O，0.0025 mg·L^-1CoCl₂·6H₂O。为培养基，培养基中附加玉米素ZT(0.01～0.05 mg·L^-1)、萘乙酸NAA(0.05～0.20 mg·L^-1)和吲哚乙酸IAA(0.10～0.30 mg·L^-1)，琼脂8.0 g·L^-1，添加蔗糖15 g·L^-1，调节pH值至5.6，嫩茎段在光照周期10 h·d^-1、光照强度900 lx和温度(25±2) ℃条件下培养。为提高朝鲜崖柏嫩茎段生根生长的速度及生根率和茎段生长长度，通过均匀设计法设计实验，选用U₁₀(10³)均匀表，每个处理接种10个嫩茎段，重复3次，筛选朝鲜崖柏茎段生根生长的玉米素、萘乙酸和吲哚乙酸最佳浓度配比。茎段培养40 d统计生根率和长度。生根率=(生根的茎段数/接种的茎段总数)×100%，茎段长度为1个培养周期后的茎段总长度(0.5＋生长长度) cm。

在培养瓶内通过节增殖方式开展快繁，小植株伸长至2.00 cm时，在无菌状态下打开培养瓶，将小植株距培养基表面0.5 cm处将苗干剪下，并切割成长度为0.5 cm的小茎段后，再次将小茎段转接到茎段生根和生长培养基中，开始生根和茎段同时生长培养，计算出每个茎段生根和生长及每瓶的增殖倍数和周期。

当种苗扩繁到一定数量后，且小植株长至2.00～3.00 cm时，将小植株从培养瓶中取出，放在杀毒矾溶液（浓度为10 mg·L^-1）中洗净根上的琼脂，将小植株栽植到经杀毒矾（100倍液）消毒过的草炭土、腐烂松针和河砂 (4: 3: 1)的基质中，覆盖塑料薄膜（透性好）进行保湿保温，控制温度为(18±2) ℃，保持相对湿度在75%，10 h·d^-1的自然光照，中午温度升高时适当打开薄膜换气通风，早晚喷洒1次清水。

2  结果与分析

2.1  玉米素、吲哚乙酸和萘乙酸对朝鲜崖柏茎段生根的影响

实验所得数据(表1)经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为Y=101＋213X₁-－82.0X₂－65.3X₃，显著性水平α＝0.05，复相关系数R＝0.9843，剩余标准差S＝1.7900，检验值F_t＝62.26﹥临界值F_(0.05,3,6)＝4.757，回归方程具有显著性，玉米素、吲哚乙酸和萘乙酸对生根的影响均具有显著性。通过计算玉米素、吲哚乙酸和萘乙酸对生根的贡献值和贡献率可知，U₁＝90.6，U₁/U＝15.2%；U₂＝330，U₂/U＝55.5%；U₃＝126，U₃/U＝21.2%，说明吲哚乙酸远大于玉米素和萘乙酸对生根的贡献，因吲哚乙酸和萘乙酸与生根率呈负相关，而玉米素与生根率呈正相关。由此推测，吲哚乙酸和萘乙酸的质量浓度分别低于0.10 mg·L^-1和0.05 mg·L^-1，以及高于0.05 mg·L^-1的玉米素可能有更高的生根率。为验证此可能性的存在与否，又以吲哚乙酸质量浓度0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01和0.00 mg·L^-1，为萘乙酸质量浓度为0.05、0.04、0.03、0.02、0.01和0.00 mg·L^-1，玉米素为0.10、0.09、0.08、0.07、0.06和0.05 mg·L^-1开展11个补充试验，重复3次。具体操作为，将0.50 cm长的朝鲜崖柏茎段转接到含有IAA（0.00～0.10 mg·L^-1）、NAA（0.00～0.05 mg·L^-1）和ZT（0.05～0.10 mg·L^-1）的培养基中，开始验证试验，17 d后发现，在距离切口0.20～0.40 cm的苗干的表面出现白色小突起，28 d后小突起渐渐变形为白色锥状，36 d后锥状伸长形成不定根，经过40 d的培养，有5～7条不定根形成，侧根上也出现白色根锥，发现ZT质量浓度为(0.06～0.08 mg·L^-1)、NAA质量浓度为(0.01～0.03 mg·L^-1)和IAA质量浓度为(0.02～0.04 mg·L^-1)时朝鲜崖柏茎段生根率最高，平均生根率达98.7%以上。且比表1所列10个处理的生根率均高。

表1  朝鲜崖柏嫩茎段生根生长激素筛选的U₁₀(10³)试验设计与结果

Table1  U₁₀(10³)test design and result of hormone for rooting and growing of tender stems of Thuja koraiensis

2.1  玉米素、吲哚乙酸和萘乙酸对朝鲜崖柏茎段生长的影响

实验所得数据(表1)经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为Y=1.38＋14.7X₁-－1.94X₂，显著性水平α＝0.05，复相关系数R＝0.9179，剩余标准差S＝0.1280，检验值F_t＝18.72﹥临界值F_(0.05,2,7)＝4.737，回归方程具有显著性，玉米素和吲哚乙酸均对朝鲜崖柏嫩茎段的生长影响具有显著性，萘乙酸对朝鲜崖柏嫩茎段的生长影响不显著。同理，计算玉米素和吲哚乙酸对茎段生长的贡献值和贡献率可知，U₁＝0.429，U₁/U＝69.5%；U₂＝0.188，U₂/U＝30.5%，说明玉米素远大于吲哚乙酸对茎段生长的贡献，因吲哚乙酸与茎段生长呈负相关，而玉米素与茎段生长呈正相关。由此推测，吲哚乙酸的质量浓度低于0.10 mg·L^-1，以及高于0.05 mg·L^-1的玉米素可能茎段的生长更好。为验证推测，又以吲哚乙酸质量浓度0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01和0.00 mg·L^-1，玉米素为0.10、0.09、0.08、0.07、0.06和0.05 mg·L^-1开展11个补充试验，重复3次。结果发现，玉米素质量浓度在0.05～0.10 mg·L^-1范围内，吲哚乙酸质量浓度在0.01～0.07 mg·L^-1范围内，朝鲜崖柏茎段生长均较好，有的茎段侧芽也开始萌发并生长，经过40 d的培养，茎段长度平均高度2.08 cm，比表1所列10个处理的茎段长度均大。

通过以上实验结果可知，由于影响生根的因素是培养基、ZT(0.06～0.08 mg·L^-1)、NAA(0.01～0.03 mg·L^-1)和IAA(0.02～0.04 mg·L^-1)，而茎段生长的的主要影响因素为培养基、ZT(0.05～0.10 mg·L^-1)和IAA(0.01～0.07 mg·L^-1)，NAA对茎段生长影响不显著，因此，可以确定朝鲜崖柏茎段生根同时生长的培养基为：培养基＋ZT(0.06～0.08 mg·L^-1)＋NAA(0.01～0.03 mg·L^-1)＋IAA(0.02～0.04 mg·L^-1)。

2.2  朝鲜崖柏植株高效再生体系建立

按照1.2中的方法，每38天一个增殖周期，按每瓶接种10个茎段，每个茎段在一个周期内可切割成（4～6）段计算，每年有n个周期（朝鲜崖柏每年8个周期）进行扩繁，年生产朝鲜崖柏种苗数为：∑年产试管苗=10×(4～6)ⁿ株，可见本发明可以满足朝鲜崖柏工厂化育苗的需要。 

2.3  朝鲜崖柏小植株的炼苗和移栽

根据1.2中的方法，当种苗扩繁到一定数量后，选取2.00 cm以上的小植株进行炼苗移栽，经统计计算，小植株成活率可达到95.0%以上。