特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用

摘要

本发明提供一种特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体，包括pLVX-AcGFP-C1表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP3A4基因cDNA序列；所述多克隆位点包括XhoI酶切位点和XmaI酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列包括XhoI酶切位点、CYP3A4基因编码序列和XmaI酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列正向插入所述多克隆位点序列中。本发明提供的慢病毒表达载体具有转染效率高、用量少、可特异、持续、高效、稳定地表达CYP3A4基因的优点，可作为有力工具应用于与CYP3A4相关的药物研究与开发。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

细胞色素P450酶(Cytochrome P450, CYP450)是一类重要的混合功能氧化酶系统，主要分布在生物体的内质网上和线粒体中，参与许多内源性和外源性物质的生物转化过程。CYP3A4属于CYP450家族中的CYP3A亚族，由CYP3A4基因编码，主要存在于肝脏中，约占肝脏CYP酶总量的30-40%，是肝脏中含量最丰富的CYP，也是最重要的人类药物代谢酶。CYP3A4参与代谢大约38类多于150种的临床治疗药物，包括抗生素、抗真菌药物、安定药物、抗组胺剂、抗抑郁药物、激素以及钙拮抗剂等等，此外，CYP3A4还参与一些前体致癌物的激活过程。因为其广泛的代谢底物谱，许多药物不良反应是由药物相互作用导致CYP3A4的代谢活性改变所引起的。

现有技术中，阮昊和徐田雪分别将CYP3A4基因cDNA片段连接到了pFastBac载体上，并将其包装成杆状病毒后感染sf9细胞，得到了能表达CYP3A4基因的sf9细胞，该细胞能够用于体外研究药物代谢，但因不是人源细胞不适用于外源物质对人毒理的相关研究；李敏将CYP3A4基因cDNA片段连接到了pYES2/CT-PCR载体上并将其导入到酿酒酵母BJ5628中实现CYP3A4的稳定表达，但因非人源细胞也不适用于外源物质对人毒理的相关研究。现有技术中尚无可在人源细胞中持续、稳定且高效表达CYP3A4基因的载体。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，发明人在载体的选择、重组构建方法等方面进行了大量的探索研究，预料不到地发现，将包含Xho I酶切位点和Xma I酶切位点的CYP3A4基因cDNA序列插入pLVX-AcGFP1-C1表达载体的多克隆位点中可成功构建特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体，从而完成本发明。

本发明提供一种特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体，包括pLVX-AcGFP-C1表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP3A4基因cDNA序列；所述多克隆位点包括Xho I酶切位点和Xma I酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列包括Xho I酶切位点、CYP3A4基因编码序列和Xma I酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列正向插入所述多克隆位点序列中。

采用上述技术方案，本发明提供的CYP3A4基因cDNA序列插入pLVX-AcGFP1-C1表达载体构建得到的慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，可持续、高效、稳定地提高CYP3A4基因表达的优点，可作为有力工具应用于制备治疗CYP3A4基因表达异常相关疾病药物的研究和开发中。

作为本发明的进一步改进，所述CYP3A4基因编码序列通过PCR扩增获得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为：5’-CCGCTCGAGACATGGCTCTCATCCCAGACTT-3’，即SEQ ID NO：1，所述下游引物的序列为：5’-ACCCGGGTCAGGCTCCACTTACGGTGCCATCC-3’，即SEQ ID NO：2。采用上述PCR引物序列，通过PCR可以扩增出CYP3A4基因编码序列，并可成功插入至pLVX-AcGFP1-C1表达载体中持续表达CYP3A4基因，减少了序列合成费用，成本较低。

相应的，本发明还提供特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤：

A） CYP3A4基因引物设计：根据CYP3A4基因编码序列，使用Oligo 7分析后选取5’-CCGCTCGAGACATGGCTCTCATCCCAGACTT-3’，即SEQ ID NO：1作为上游引物，选取5’-ACCCGGGTCAGGCTCCACTTACGGTGCCATCC -3’，即SEQ ID NO：2作为下游引物，然后合成所述上游引物和所述下游引物；所述上游引物和所述下游引物无引物二聚体，且退火温度差距较小；

B） CYP3A4基因cDNA序列的获得：用所述上游引物和所述下游引物进行PCR扩增，获得大量CYP3A4基因编码序列，然后将该序列进行加A尾反应后，用T4 DNA连接酶连接到pGM-T载体上得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明CYP3A4基因cDNA序列插入成功的菌液进行测序鉴定；用液体LB培养基培养测序鉴定正确的大肠杆菌，并抽提其中带CYP3A4基因cDNA序列的pGM-T载体，用限制性内切酶XhoⅠ酶切回收后再用XmaⅠ酶切，电泳、切胶回收1526 bp大小的片段，此片段即为CYP3A4基因cDNA序列；

C） 特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒载体的构建和鉴定：提取质粒pLVX-AcGFP1-C1，用限制性内切酶XhoⅠ酶切回收后再用XmaⅠ酶切，电泳、切胶回收载体，再用T4 DNA ligase将所述CYP3A4基因cDNA序列连接到pLVX-AcGFP1-C1表达载体中，得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明CYP3A4基因cDNA序列插入成功的菌液进行测序鉴定；

D）  特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒载体的抽提：将测序结果证实CYP3A4基因cDNA序列插入成功的菌液扩增培养，对重组质粒进行抽提，得到特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体。

本发明利用基因工程技术构建特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体，经鉴定构建成功后，包装成病毒转导入L-02肝细胞，嘌呤霉素筛选细胞后，使用实时荧光定量PCR和Western Blot技术分别从mRNA和蛋白水平验证CYP3A4基因表达的变化，实验结果证明本发明提供的CYP3A4基因cDNA序列成功插入至pLVX-AcGFP1-C1表达载体中，能特异、持续、高效、稳定地促进CYP3A4基因高表达。

本发明还提供特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体在制备治疗CYP3A4基因表达异常相关疾病的药物中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明提供的特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，能特异、持续、高效、稳定地促进CYP3A4基因高表达的优点，可作为有力工具应用于与CYP3A4相关的药物研究和开发中；本发明还提供了特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体的构建方法，操作效果好，减少了序列合成费用，成本较低。

附图说明

图1 为pLVX-AcGFP1-C1表达载体的质粒图谱。

图2 为3A4-T载体菌液PCR的结果示意图。

图3 为pLVX-CYP3A4载体菌液PCR的结果示意图。

图4 为pLVX-CYP3A4载体测序结果示意图。

图5 为嘌呤霉素筛选细胞后荧光定量PCR检测结果示意图。

图6 为嘌呤霉素筛选细胞后Western blot检测结果示意图。

图7 为嘌呤霉素筛选细胞连续培养20代后Western blot检测结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步的说明。

L-02肝细胞购自上海生命科学院细胞资源中心，293FT细胞购自Invitrogen公司，Premix PrimeSTAR HS酶、慢病毒表达载体pLVX-AcGFP1-C1、病毒包装辅助试剂盒、Lenti-X GoStix试剂盒均购自Takara公司， RNeasy Mini Kit购自Qiagen 公司，pGM-T载体购自天根公司，Endo-Free Plasmid Mini Kit II购自Omega bio-tek公司。

实施例一  CYP3A4基因引物的设计。

根据CYP3A4基因编码序列（GenBank NM_001202855.2），使用Oligo7对其进行分析，寻找上游引物和下游引物（要求尽可能无引物二聚体且退火温度差距较小），然后在上游引物和下游引物的5’端分别加入保护碱基与酶切位点Xho I和Xma I，设计得到的引物序列如表1所示。设计的PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

实施例二  特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒载体的构建。

将合成的引物稀释后，用Premix PrimeSTAR HS酶对CYP3A4基因的编码序列进行扩增，电泳回收后然后将其进行加A尾反应后，用T4 DNA连接酶连接到pGM-T载体上得到连接产物（3A4-T载体），将该连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，于37℃培养12 h，同时设置阴性对照组1（将感受态细胞均匀涂布在不含氨苄青霉素的平板上）、阴性对照组2（将感受态细胞均匀涂布在含100 μg/ml氨苄青霉素的平板上）、阳性对照组1（将双酶切空载体的连接产物均匀涂布在含100 μg/ml氨苄青霉素的平板上）、阳性对照组2（将空载体均匀涂布在含100 μg/mL氨苄青霉素的平板上）。实验组长出了单菌落，阴性对照组1长出了菌落；阴性对照组2、阳性对照组1、阳性对照组2没长出菌落。

从实验组中挑取8个单菌落培养保存后，各取0.5 μL培养液，用CYP3A4基因的引物进行PCR扩增来初步鉴定。结果如图2所示，表明8个单菌落的培养液均能成功扩增出CYP3A4基因，接着将重组载体送至上海生工公司测序。

取测序结果正确的菌，置于液体LB培养基中培养14 h，然后提取3A4-T载体，将3A4-T载体和pLVX-AcGFP1-C1载体先用Xho I酶进行酶切，电泳回收后再用Xma I酶进行酶切，再进行电泳回收，最后将回收产物用T4 DNA连接酶连接，再次转化到感受态大肠杆菌DH5α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，于37℃培养12 h，同时设置阴性对照组1（将感受态细胞均匀涂布在不含氨苄青霉素的平板上）、阴性对照组2（将感受态细胞均匀涂布在含100 μg/mL氨苄青霉素的平板上）、阳性对照组1（将双酶切空载体的连接产物均匀涂布在含100 μg/mL氨苄青霉素的平板上）、阳性对照组2（将空载体均匀涂布在含100 μg/mL氨苄青霉素的平板上）。实验组长出了单菌落，阴性对照组1长出了菌落；阴性对照组2、阳性对照组1、阳性对照组2没长出菌落。

从实验组中挑取6个单菌落培养保存后，各取0.5 μL培养液，用CYP3A4基因的引物进行PCR扩增来初步鉴定。结果如图3所示，表明全部6支培养液均能成功扩增出CYP3A4基因，接着将这些重组载体菌液送至上海生工公司测序，测序结果如图4所示，与预期完全相符。

取出之前保存的重组质粒菌液，取20 μl接种到15 ml LB培养基（含100 μg/ml氨苄青霉素）中，37℃，300 rpm培养16 h，用Endo-Free Plasmid Mini Kit II进行抽提重组质粒pLVX-CYP3A4，测其纯度和浓度，结果如表2所示。

实施例三  慢病毒包装

培养293FT细胞，取生长状态良好的细胞接种到六孔中，每孔10⁶个细胞，用慢病毒包装辅助试剂盒，取抽提的重组质粒pLVX-CYP3A4 2μg转染到293FT细胞，48h后收集含病毒的上清培养基，用0.45μm的筛子过滤病毒液，用于感染L-02肝细胞，Lenti-X GoStix试剂盒检测病毒的滴度为5×10⁶～5×10⁷IFU。

实施例四  慢病毒转导L-02肝细胞。

接种L-02肝细胞于6孔板中，每孔10⁶个细胞，12h后细胞密度约为50%，分别取病毒液，用RPMI-1640完全培养基10倍稀释病毒，再加入聚凝胺（polybrene）至终浓度为8 μg/mL。去6孔板中的培养基，加入含病毒的RPMI-1640完全培养基（含10%胎牛血清），24h后弃去含病毒的RPMI-1640完全培养基，更换新鲜的RPMI-1640完全培养基，24h后用0.5μg/ml浓度的嘌呤霉素筛选细胞。筛选10d，每隔3d更换培养基一次，并不断的增加嘌呤霉素的浓度至1.00 μg/ml。

实施例五  荧光定量PCR检测CYP3A4基因表达量。

根据GAPDH和CYP3A4基因mRNA序列，利用引物设计软件Oligo 7.0设计引物。

分别接种L-02肝细胞、pLVX空载体对照L-02细胞、pLVX-CYP3A4高表达细胞至6孔板。细胞密度达到80%-90%时，用RNeasy Mini Kit提取各组细胞的总RNA，利用PrimeScrip RT reagent Kit将mRNA逆转录为cDNA，逆转录条件：37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞。反转录结束后，加入90μl的RNase Free dH₂O稀释cDNA，-20℃保存，以便后面检测使用。取各组细胞的cDNA 1μl为模板，以GAPDH为内参，实时荧光定量PCR（QPCR）检测CYP3A4相对表达量，设置反应条件：95℃ 30s，1循环，54℃ 30s 40循环，95℃ 5s，60℃ 1min，95℃ 15s，利用SYBR Primescript RT-PCR Kit检测各组细胞CYP3A4基因相对表达量。将pLVX-CYP3A4细胞连续培养20代后，重复以上实验。汇总后的结果如图5所示。可以看到，不管是刚筛选完，还是已经培养20代后的pLVX-CYP3A4细胞，其CYP3A4基因的表达量较L-02细胞都有300倍左右的升高，而pLVX空载体细胞的CYP3A4基因表达量与L-02细胞相比基本没有变化，说明本发明提供的CYP3A4基因cDNA序列成功插入至pLVX-AcGFP1-C1表达载体中，能特异、持续、高效、稳定地促进CYP3A4基因高表达。

实施例六  Western blot检测CYP3A4蛋白质表达量。

分别取L-02肝细胞、pLVX空载体对照L-02细胞、pLVX-CYP3A4高表达细胞1瓶（25cm² 细胞培养瓶），去培养基，用冷PBS洗3次，加入200 μl细胞裂解液，并用细胞刮将裂解的细胞快速从瓶壁刮下，收集蛋白至500μl的EP管中，4℃继续裂解30 min，12000rpm，4℃离心20min，最后加入5×SDS-PAGE Sample Loading Buffer，100℃变性5min，进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1h；分别加入CYP3A4抗体、GAPDH抗体，4℃孵育过夜。 TBST洗膜3次，每10min一次，再加入二抗，室温孵育1h，TBST洗膜3次，每10min一次。加入Western blot化学发光试剂后进行成像分析，结果如图6所示。以GAPDH为内参，结果表明pLVX-CYP3A4细胞的CYP3A4蛋白表达量有明显升高，约为正常L-02细胞的5.41倍，蛋白表达量显著升高。

连续培养细胞20代后，分别提取pLVX-CYP3A4细胞及其对照组细胞，Western blotting 分析CYP3A4蛋白表达量，结果如图7所示，与之前的结果接近。这说明pLVX-CYP3A4细胞构建成功，能持续、高效、稳定地高表达CYP3A4基因。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

 

                         SEQUENCE LISTING

<110>  深圳市疾病预防控制中心

<120>  特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用

<130>  1

<160>  6     

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

ccgctcgaga catggctctc atcccagact t                                     31

<210>  2

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

acccgggtca ggctccactt acggtgccat cc                                   32

<210>  3

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

tctgacttca acagcgacac c                                               21

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

ctgttgctgt agccaaattc gt                                              22

<210>  5

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

gctcctctat ctatatggaa ccc                                             23

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

aaagccctta tggtaggaca                                                 20