APE1特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及其在人肝癌MHCC97-H细胞中APE1基因沉默效应的观察

摘要

目的：
　　 构建慢病毒表达载体LV-APE1-shRNA，观察其介导的RNA干扰对人高侵袭肝癌细胞株MHCC97-H中APE1基因mRNA和蛋白的表达的影响，并进行功能学检测分析，为进一步探讨APE1在肝癌侵袭和转移中的作用机制提供理论基础和实验依据。
　　 方法：
　　 设计4对干扰靶序列，分别与pGCSIL-GFP载体连接、转化、并测序鉴定，将重组质粒命名为KD1～KD4。通过Western blot筛选最有效的靶点，将筛选到的重组质粒与pHelper1.0，pHelper2.0共转染293T细胞，包装生产慢病毒颗粒并测定其病毒滴度。将包装产生的慢病毒颗粒感染MHCC97-H细胞，通过RT-PCR和Westem blot检测其干扰效率，通过免疫细胞化学观察APE1表达的定位变化；利用噻唑兰比色(MTT)方法检测APE1干扰前后MHCC97-H细胞的增殖能力的变化；应用流式细胞术(FCM)检测APE1基因抑制后MHCC97-H细胞的周期变化；应用体外黏附实验观察APE1基因抑制前后MHCC97-H细胞黏附能力的变化；通过Transwell侵袭实验观察APE1基因抑制前后，MHCC97-H细胞的趋化运动能力和侵袭能力的变化。
　　 结果：
　　 1.通过PCR筛选阳性克隆和DNA测序鉴定，与设计的序列一致，通过Westem blot筛选到KD3的干扰效率达90％以上。将KD3与pHelper1.0，pHelper2.0共转染肾胚293T细胞，包装生产慢病毒颗粒LV-APE1-shRNA，测定其病毒滴度为4x108TU/mL。
　　 2.LV-APE1-shRNA感染MHCC97-H细胞后，APE1基因的mRNA和蛋白的表达量与未感染组和空载体病毒感染组相比均明显下降，免疫细胞化学显示APE1的表达从胞核、胞质表达转移至仅部分胞核弱表达。
　　 3.体外增殖实验显示：与未感染组和空载体病毒感染组相比，LV-APE1-shRNA感染MHCC97-H细胞后，MHCC97-H细胞的体外增殖能力下降。细胞周期实验显示：与未感染组和空载体病毒感染组相比，LV-APE1-shRNA感染MHCC97-H细胞后，细胞的G1期延长，而G2期和S期相对缩短。
　　 4.在体外黏附、侵袭和趋化运动实验中，与未感染组和空载体病毒感染组相比，LV-APE1-shRNA组的MHCC97-H细胞的黏附能力、侵袭能力及趋化运动能力均不同程度的下降。
　　 结论：
　　 1.本课题所构建的慢病毒载体可显著、稳定的抑制APE1基因的表达，为后续研究奠定可靠的基础。
　　 2.APE1基因抑制后MHCC-97细胞的增殖、黏附、趋化运动和侵袭能力等恶性生物学行为均受到不同程度的抑制，提示APE1参与调控肝细胞癌增殖活性以及侵袭转移能力，为肝细胞癌患者的肿瘤靶向治疗提供理论基础，并为后续的肝细胞癌侵袭转移机制研究提供了实验依据。

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综述 APE1基因的研究进展