甘薯胚性细胞悬浮培养方法及通过该方法得到的胚性细胞

摘要

本发明涉及一种甘薯胚性细胞的悬浮方法，其主要特征是将甘薯胚性愈伤组织按接种密度0.5∶25-4.0∶25(SCV：total ml of suspension culture)放入置于100r/min摇床的、含2.0mg/L2，4-D的MS液体培养基的培养瓶中培养。通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.6-3.96倍左右，且胚性悬浮细胞质量非常好；特别是当接种密度为2.0∶25时，其培养的效率最高，7天后可增殖到原来的3.96倍。

说明书

技术领域

本发明涉及一种甘薯胚性细胞的悬浮培养方法及通过该方法得到的胚性细 胞。

背景技术

传统的甘薯转基因受体大多采用叶片、叶柄等外植体，但这些外植体再生率 较低，不适合做生物工程材料。在2003年出版的《中国农业科学》第36卷第5 期第487-491页披露了一种甘薯胚性细胞悬浮培养系，是一种较理想的生物工程 材料，但是这种甘薯胚性悬浮培养系培养效率还不高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高效的甘薯胚性细胞悬浮培养方法。

将在含2.0mg/L2，4-D的MS培养基上诱导得到的甘薯胚性愈伤组织，按接 种密度0.5∶25-4.0∶25，放入置于100r/min摇床含2，4-D浓度为2.0mg/LMS液体培 养基的培养瓶中培养。

通过此种方法培养的胚性悬浮细胞在7天后即可增殖到原来的1.6-3.96倍， 且胚性悬浮细胞质量较好，并且，这个接种密度可以作为甘薯细胞悬浮培养中试 放大的重要参考数据。

优选方案是在接种密度2.0∶25(SCV：total ml of suspension culture)放入置 于100r/min摇床含2，4-D浓度为2.0mg/LMS液体培养基的培养瓶中培养。

通过此种方法培养的胚性悬浮细胞7天后可增殖到原来的3.96倍。

具体实施方式

本发明的优点在于：与其它悬浮细胞培养方法相比，培养所得的胚性细胞 质量相当，但培养的效率显著提高。

下面以甘薯徐55-2为例，详细介绍本发明的实施例。

实施例1：

取苗床生长旺盛、长1cm的徐55-2茎尖，用70％的酒精表面杀毒30s后立 即转入0.1％HgCl23min，而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm的茎尖分省组织，而后接种在含2.0mg/L2，4-D的MS培养基上(3％ 蔗糖，0.8％琼脂，pH＝5.8)，在28±2℃、黑暗条件下进行培养，诱导胚性愈伤 组织。

培养8周后，将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团，转入100mL三 角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液体培养基，该培养基的成分同上述胚性愈 伤组织诱导培养基，但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。悬浮培养7-10天继代一次。

将0.5mLSCV(SCV：total ml of suspension culture)胚性悬浮培养细胞接 入25mL含2.0mg/L2，4-D的MS液体培养基中，置于100r/min摇床上培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。

通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.67倍， 且胚性悬浮细胞质量较好。

实施例2：

取苗床生长旺盛、长1cm的徐55-2茎尖，用70％的酒精表面杀毒30s后立 即转入0.1％HgCl23min，而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm的茎尖分省组织，而后接种在含2.0mg/L2，4-D的MS培养基上(3％ 蔗糖，0.8％琼脂，pH＝5.8)，在28±2℃、黑暗条件下进行培养，诱导胚性愈伤 组织。

培养8周后，将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团，转入100mL三 角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液体培养基，该培养基的成分同上述胚性愈 伤组织诱导培养基，但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。悬浮培养7-10天继代一次。

将0.6mLSCV(SCV：total ml of suspension culture)胚性悬浮培养细胞接 入25mL含2.0mg/L2，4-D的MS液体培养基中，置于100r/min摇床上培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。

通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.95倍左 右，且胚性悬浮细胞质量较好。

实施例3：

取苗床生长旺盛、长1cm的徐55-2茎尖，用70％的酒精表面杀毒30s后立 即转入0.1％HgCl23min，而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm的茎尖分省组织，而后接种在含2.0mg/L2，4-D的MS培养基上(3％ 蔗糖，0.8％琼脂，pH＝5.8)，在28±2℃实、黑暗条件下进行培养，诱导胚性愈 伤组织。

培养8周后，将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团，转入100mL三 角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液体培养基，该培养基的成分同上述胚性愈 伤组织诱导培养基，但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。悬浮培养7-10天继代一次。

将1.0mLSCV(SCV：total ml of suspension culture)胚性悬浮培养细胞接 入25mL含2.0mg/L2，4-D的MS液体培养基中，置于100r/min摇床上培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。

通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的2.86倍， 且胚性悬浮细胞质量非常好。

实施例4：

取苗床生长旺盛、长1cm的徐55-2茎尖，用70％的酒精表面杀毒30s后立 即转入0.1％HgCl23min，而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm的茎尖分省组织，而后接种在含2.0mg/L2，4-D的MS培养基上(3％ 蔗糖，0.8％琼脂，pH＝5.8)，在28±2℃实、黑暗条件下进行培养，诱导胚性愈 伤组织。

培养8周后，将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团，转入100mL三 角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液体培养基，该培养基的成分同上述胚性愈 伤组织诱导培养基，但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。悬浮培养7-10天继代一次。

将2.0mLSCV(SCV：total ml of suspension culture)胚性悬浮培养细胞接 入25mL含2.0mg/L2，4-D的MS液体培养基中，置于100r/min摇床上培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。

通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的3.96倍， 且胚性悬浮细胞质量非常好。

实施例5：

取苗床生长旺盛、长1cm的徐55-2茎尖，用70％的酒精表面杀毒30s后立 即转入0.1％HgCl23min，而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm的茎尖分省组织，而后接种在含2.0mg/L2，4-D的MS培养基上(3％ 蔗糖，0.8％琼脂，pH＝5.8)，在28±2℃实、黑暗条件下进行培养，诱导胚性愈 伤组织。

培养8周后，将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团，转入100mL三 角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液体培养基，该培养基的成分同上述胚性愈 伤组织诱导培养基，但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。悬浮培养7-10天继代一次。

将3.9mLSCV(SCV：total ml of suspension culture)胚性悬浮培养细胞接 入25mL含2.0mg/L2，4-D的MS液体培养基中，置于100r/min摇床上培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。

通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.95倍， 且胚性悬浮细胞质量较好。

实施例6：

取苗床生长旺盛、长1cm的徐55-2茎尖，用70％的酒精表面杀毒30s后立 即转入0.1％HgCl23min，而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm的茎尖分省组织，而后接种在含2.0mg/L2，4-D的MS培养基上(3％ 蔗糖，0.8％琼脂，pH＝5.8)，在28±2℃实、黑暗条件下进行培养，诱导胚性愈 伤组织。

培养8周后，将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团，转入100mL三 角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液体培养基，该培养基的成分同上述胚性愈 伤组织诱导培养基，但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。悬浮培养7-10天继代一次。

将4.0mLSCV(SCV：total ml of suspension culture)胚性悬浮培养细胞接 入25mL含2.0mg/L2，4-D的MS液体培养基中，置于100r/min摇床上培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。

通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.7倍， 且胚性悬浮细胞质量较好。

比较例1：

取苗床生长旺盛、长1cm的徐55-2茎尖，用70％的酒精表面杀毒30s后立 即转入0.1％HgCl23min，而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm的茎尖分省组织，而后接种在含2.0mg/L2，4-D的MS培养基上(3％ 蔗糖，0.8％琼脂，pH＝5.8)，在28±2℃、黑暗条件下进行培养，诱导胚性愈伤 组织。

培养8周后，将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团，转入100mL三 角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液体培养基，该培养基的成分同上述胚性愈 伤组织诱导培养基，但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。悬浮培养7-10天继代一次。

将0.2mLSCV(SCV：total ml of suspension culture)胚性悬浮培养细胞接 入25mL含2.0mg/L2，4-D的MS液体培养基中，置于100r/min摇床上培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。

通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.25倍左 右，且胚性悬浮细胞质量较差。

比较例2：

取苗床生长旺盛、长1cm的徐55-2茎尖，用70％的酒精表面杀毒30s后立 即转入0.1％HgCl23min，而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm的茎尖分省组织，而后接种在含2.0mg/L2，4-D的MS培养基上(3％ 蔗糖，0.8％琼脂，pH＝5.8)，在28±2℃、黑暗条件下进行培养，诱导胚性愈伤 组织。

培养8周后，将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团，转入100mL三 角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液体培养基，该培养基的成分同上述胚性愈 伤组织诱导培养基，但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。悬浮培养7-10天继代一次。

将0.3mLSCV(SCV：total ml of suspension culture)胚性悬浮培养细胞接 入25mL含2.0mg/L2，4-D的MS液体培养基中，置于100r/min摇床上培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。

通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.34倍左 右，且胚性悬浮细胞质量较差。

比较例3：

取苗床生长旺盛、长1cm的徐55-2茎尖，用70％的酒精表面杀毒30s后立 即转入0.1％HgCl23min，而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm的茎尖分省组织，而后接种在含2.0mg/L2，4-D的MS培养基上(3％ 蔗糖，0.8％琼脂，pH＝5.8)，在28±2℃、黑暗条件下进行培养，诱导胚性愈伤 组织。

培养8周后，将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团，转入100mL三 角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液体培养基，该培养基的成分同上述胚性愈 伤组织诱导培养基，但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。悬浮培养7-10天继代一次。

将0.4mLSCV(SCV：total ml of suspension culture)胚性悬浮培养细胞接 入25mL含2.0mg/L2，4-D的MS液体培养基中，置于100r/min摇床上培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。

通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.46倍左 右，且胚性悬浮细胞质量一般。

比较例4：

取苗床生长旺盛、长1cm的徐55-2茎尖，用70％的酒精表面杀毒30s后立 即转入0.1％HgCl23min，而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm的茎尖分省组织，而后接种在含2.0mg/L2，4-D的MS培养基上(3％ 蔗糖，0.8％琼脂，pH＝5.8)，在28±2℃、黑暗条件下进行培养，诱导胚性愈伤 组织。

培养8周后，将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团，转入100mL三 角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液体培养基，该培养基的成分同上述胚性愈 伤组织诱导培养基，但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。悬浮培养7-10天继代一次。

将4.1mLSCV(SCV：total ml of suspension culture)胚性悬浮培养细胞接 入25mL含2.0mg/L2，4-D的MS液体培养基中，置于100r/min摇床上培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。

通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.65倍， 且胚性悬浮细胞质量一般。

比较例5：

取苗床生长旺盛、长1cm的徐55-2茎尖，用70％的酒精表面杀毒30s后立 即转入0.1％HgCl23min，而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm的茎尖分省组织，而后接种在含2.0mg/L2，4-D的MS培养基上(3％ 蔗糖，0.8％琼脂，pH＝5.8)，在28±2℃、黑暗条件下进行培养，诱导胚性愈伤 组织。

培养8周后，将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团，转入100mL三 角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液体培养基，该培养基的成分同上述胚性愈 伤组织诱导培养基，但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。悬浮培养7-10天继代一次。

将4.2mLSCV(SCV：total ml of suspension culture)胚性悬浮培养细胞接 入25mL含2.0mg/L2，4-D的MS液体培养基中，置于100r/min摇床上培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。

通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.60倍左 右，且胚性悬浮细胞质量较差。

比较例6：

取苗床生长旺盛、长1cm的徐55-2茎尖，用70％的酒精表面杀毒30s后立 即转入0.1％HgCl23min，而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm的茎尖分省组织，而后接种在含2.0mg/L2，4-D的MS培养基上(3％ 蔗糖，0.8％琼脂，pH＝5.8)，在28±2℃、黑暗条件下进行培养，诱导胚性愈伤 组织。

培养8周后，将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团，转入100mL三 角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液体培养基，该培养基的成分同上述胚性愈 伤组织诱导培养基，但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。悬浮培养7-10天继代一次。

将4.3mLSCV(SCV：total ml of suspension culture)胚性悬浮培养细胞接 入25mL含2.0mg/L2，4-D的MS液体培养基中，置于100r/min摇床上培养，培 养条件为28±2℃，每天13h、500lx光照。

通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.58倍左 右，且胚性悬浮细胞质量较差。

上述的实施例对本发明优选方式作了详细说明，但本发明不限于上述实施 方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以不脱离本发明宗旨的 前提下作出各种变化。