甘薯胚性悬浮细胞遗传转化体系的建立及SBD2基因在甘薯淀粉粒中表达的研究

摘要

本研究以徐薯55-2为材料，首先建立其胚性悬浮细胞系；然后以该悬浮细胞系为受体，建立了农杆菌介导的甘薯悬浮细胞系遗传转化体系；在此基础上，将具有淀粉结合功能的淀粉结合结构域SBD2转入甘薯55-2中，进而分析了SBD2的表达和转基因甘薯淀粉的理化性质。结果如下： 1、农杆菌介导的徐薯55-2悬浮细胞系遗传转化条件的确立 将徐薯55-2茎尖接种到MS+2mg/L2，4-D固体培养基上诱导得到胚性愈伤，胚性愈伤在MS+2mg/L2，4-D液体培养基中培养80-120d后形成再生能力强的悬浮细胞系。利用建立的悬浮细胞系为材料，对根癌农杆菌EHA105介导的甘薯遗传转化进行了系统的研究。该菌株所携带的pTCK303质粒上含有β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)，通过统计农杆菌侵染后GUS基因表达百分率得到如下结果：将达到对数生长的根癌农杆菌菌液稀释至为OD600nm=0.6-1.0，侵染继代培养3-4d后的胚性悬浮细胞8-12min，之后共培养3-4d达到最高的表达效率。其中采用0.45mol/L甘露醇作为渗透压处理悬浮细胞40-80min及在共培养培养基中添加200μmol/L乙酰丁香酮均能提高转化效率。 2、抗生素选择压力的确定 由于不同甘薯品种悬浮细胞对抗生素的敏感程度不同，我们首先研究不同浓度卡那霉素对徐薯55-2胚性愈伤的存活及增殖的影响，结果表明：适宜的卡那霉素浓度为10mg/L。头孢霉素、羧苄青霉素及万古霉素是遗传转化中常用的去除农杆菌的抗菌素，我们比较三种抗生素对徐薯55-2胚性愈伤增殖和体细胞胚的分化的影响，研究表明：最合适的抗生素为头孢霉素，其对徐薯55-2的增殖和体细胞胚的分化影响比较小，并且其抑制农杆菌的效果比较好，适宜的浓度为200mg/L。 3、遗传转化与植株再生 利用上述建立的转化体系，研究了淀粉结合结构域(SBD2)基因的遗传转化，根癌农杆菌EHA105携带质粒pBIN19，该质粒携带SBD2和NPTII基因。将根癌农杆菌EHA105侵染后的胚性悬浮细胞转移到含有2.0 mg/L2，4-D、10 mg/L Kan和200mg/L Cefo的MS液体培养基中进行选择培养，经过4-8周的选择培养，获得抗Kan的愈伤组织。将得到的Kan抗性愈伤组织转移到添加200 mg/L Cefo、10 mg/L Kan、1.0 mg/L ABA和1.0 mg/LGA3的MS固体培养基上，Kan抗性愈伤组织分化，共产生35个抗性芽，将这些芽转移到含10 mg/L Kan的MS基本培养基上，获得了12株再生植株.PCR和Southern检测结果表明，12株再生植株是转基因植株，斑点杂交证实SBD2在转基因甘薯淀粉中得到表达，在不同转基因株系中表达量有差异. 4、转基因甘薯淀粉理化特性分析 通过光学显微镜(LM)和电镜(SEM)对转基因植株以及对照植株块根中的淀粉粒进行理化性质的比较分析。观察发现，转基因淀粉颗粒形态与对照有差异，在转基因淀粉粒中出现许多小淀粉颗粒聚集、成簇存在的，而在对照淀粉中没有发现这种情况。但是，在淀粉颗粒大小透光率、膨胀势、表观直链淀粉含量、凝胶性质、糊化特性及热特性等理化性质方面，转基因淀粉与对照淀粉没有差异.由此可见，SBD2的导入没有改变除淀粉粒形态以外的其它淀粉理化性质，是非常好的淀粉-效应蛋白的连接锚。本实验的结论为以后利用SBD2作为“锚’对淀粉结构进行改良奠定基础。

目录

文摘

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前 言

第一章综述

1.1甘薯概述

1.2甘薯组织培养的研究

1.3甘薯遗传转化研究进展

1.3.1甘薯遗传转化的基因种类

1.3.2甘薯遗传转化受体

1.3.3甘薯基因转化的方法

1.3.4影响甘薯遗传转化的因素

1.3.5转基因技术在甘薯品种改良中的应用

1.4淀粉的研究

1.4.1淀粉的组成及结构

1.4.2淀粉的合成

1.4.3淀粉合成过程中的关键酶

1.4.4淀粉的理化性质

1.4.5淀粉应用

1.4.6淀粉的转基因修饰

1.5 SBD-转基因平台技术的研究

1.5.1微生物淀粉结合结构域(starch-binding domain,SBD)

1.5.2 SBD的分类

1.5.3 SBD的结构与功能

1.5.4 SBD转基因平台技术

1.5.5 SBD-转基因平台技术的应用

1.5.6 SBD-转基因平台技术研究的主要进展

第二章甘薯胚性悬浮细胞遗传转化的研究

2.1材料与方法

2.1.1植物材料

2.1.2农杆菌菌株及质粒

2.1.3甘薯悬浮细胞再生体系的建立

2.1.4实验中所用培养基

2.1.5遗传转化农杆菌菌株的准备

2.1.6影响农杆菌介导的甘薯遗传转化因素的研究

2.1.7 GUS基因表达活性的检测

2.2结果与分析

2.2.1影响农杆菌介导的甘薯悬浮细胞遗传转化因素的研究

2.2.2 CUS基因表达活性的检测

2.3讨论

第三章SBD2重组基因的遗传转化及在甘薯淀粉粒中表达

3.1材料与方法

3.1.1植物材料

3.1.2菌株和质粒

3.1.3主要分子生物学试剂

3.1.4主要仪器

3.1.5 pBIN19/SBD2质粒的大肠杆菌转化、扩繁及验证

3.1.6 pBIN19/SBD2质粒的农杆菌转化及其验证

3.1.7不同抗生素对胚性愈伤生长增殖及分化的研究

3.1.8农杆菌介导的甘薯遗传转化及植株再生

3.1.9转基因植株的分子检测

3.2结果与分析

3.2.1 pBIN19/SBD2质粒的农杆菌转化

3.2.2不同抗生素对胚性愈伤生长和体细胞胚分化的研究

3.2.3不同抑菌素的不同浓度对农杆菌生长的抑制作用

3.2.4抗生素对甘薯再生苗生根的影响

3.2.5植物表达载体及甘薯胚性愈伤组织的遗传转化

3.2.6转基因植株的分子检测

3.3讨论

第四章SBD2转基因甘薯淀粉理化性质的分析

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2主要仪器设备

4.1.3甘薯淀粉的分离

4.1.4淀粉颗粒大小的分析

4.1.5淀粉粒形态的观察

4.1.6直链淀粉和支链淀粉含量的测定

4.1.7淀粉晶体结构分析

4.1.8淀粉凝胶化性质测定

4.1.9透光率测定

4.1.10膨胀势测定

4.1.11冻融稳定性测定

4.1.12糊凝沉性质测定

4.1.13黏度特性测定

4.2结果与分析

4.2.1淀粉颗粒形态观察

4.2.2淀粉颗粒大小、直链淀粉和支链淀粉含量、结晶度及凝胶性质的分析

4.2.3淀粉糊化性质的分析

4.3讨论

全文结论

本研究的创新点

攻读博士学位期间发表的文章

参考文献

附录

致谢