一种载有活性成分的海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球及其制备方法

摘要

本发明公开了一种以胶原、海藻酸钠、壳聚糖为载体材料制备负载多种化妆品活性成分的微球，其制备步骤为：将胶原溶解在酸性介质中，与海藻酸钠及活性成分相混合形成均一胶体溶液；混合物通过注射器以液滴形式进入二价阳离子溶液中，通过凝胶作用形成初级微球；将微球置于壳聚糖溶液中进一步固化；用去离子水洗涤微球，微球中的胶原进行重组，海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球形成。本发明方法制得的微球表面光滑圆整，单分散性好，粒径分布均一，具有快速溶胀性质，属于一种新的化妆品活性成分负载体系，冻干后的微球可以和溶媒搭配使用，达到多组分不同功效化妆品活性成分共同作用的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型化妆品负载体系，具体涉及一种载有活性成分的海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球及其制备方法，属于化妆品制备技术领域。

背景技术

熊果苷、果酸、茴香酸等是当今流行的比较安全有效的水溶性美白原料，可以减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑。神经酰胺系为神经鞘糖脂中的一种，是一种水溶性脂质物质，可以改善角质层的保水及屏障功能，解决皮肤干燥、皱纹、粗糙现象。生长因子是具有刺激细胞生长活性的细胞因子，研究结果证明：生长因子随着年龄的增长逐渐减少，人体表现出各种衰老症状。以表皮细胞生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）为代表的一类细胞生长因子具有显著地美容效果，能够解决皮肤早衰、萎黄、皱纹、松弛等现象，具有深层修复作用。中国专利CN101732169A报道将熊果苷用于功能护肤液的配方中，日本美露香株式会社公开了将神经酰胺合成促进剂作为化妆品和皮肤外用剂的专利（CN101583345）。中国专利CN102406556A公开了一种有助于保持表皮生长因子生物活性的化妆品组合物，该组合物的主要成分是表皮生长因子、水解胶原蛋白粉、透明质酸钠等。中国专利CN101548935公开了一种酸性成纤维细胞生长因子在制备美容化妆品中的用途，同时还提供了其生产工艺。现有技术自身稳定性欠佳，受外界干扰易失活，例如在光及周围环境不合适的条件下容易分解，在空气中也容易氧化，缺少储存的稳定性，因此在化妆品应用中受到了一定的限制。

海藻酸钠(C₆H₇O₈Na)n主要由海藻酸的钠盐组成，由a-L-甘露糖醛酸(M单元)与b-D-古罗糖醛酸(G单元)依靠1,4-糖苷键连接并由不同比例的GM、MM和GG片段组成的共聚物。海藻酸钠早在1938就已收入美国药典，其温和的溶胶凝胶过程、良好的生物相容性使海藻酸钠适于作为释放或包埋药物、蛋白与细胞的微胶囊载体。壳聚糖，化学名称为β-（1,4）-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，是甲壳素N-脱乙酰基的产物，也是生物界存在的唯一一种碱性氨基多糖，不溶于水但能溶于低浓度有机酸或无机酸，以壳聚糖为载体制备的微球具有控制释药，提高药物稳定性等多方面的优势。

目前，使用最多的制备载活性蛋白或药物微球的方法有溶剂蒸发法，例如专利CN1463696报道了双乳液体系溶剂蒸发法制备载蛋白类药物的聚-DL-乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物微球，美国专利US5288502报道了利用乳化-溶剂蒸发法制备载多肽和蛋白的微球；专利CN1398584A报道了利用乳化分散法制备bFGF-PLGA缓释微球；美国专利US2007275082报道了利用喷雾干燥法双向喷嘴包载药物的方法，上述方法一般都要用到有机溶剂或者交联剂，其存在以下不足，一是容易破坏所包覆的活性物质的稳定性，二是容易残留在微球中影响微球性能，三是用到的载体以合成类高分子和半合成类高分子为主，于肌体的生物相容性欠佳。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物相容性好，不使用有机溶剂、交联剂和乳化剂，负载有多种功效化妆品活性成分的海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球。

本发明的另一目的在于提供一种工艺简单、成本低、温和环保，制备得到的活性成份稳定性好的负载有多种功效化妆品活性成分的海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球制备方法。

本发明实现过程如下：

载有活性成分的海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球，由海藻酸钠、壳聚糖、Ι型胶原和活性成分制备得到，其中复合微球中海藻酸钠、壳聚糖、Ι型胶原和活性成分重量比为3~10：2~9：1~3：2~5，所述的活性成分选自美白活性成分、保湿活性成分神经酰胺和抗衰老活性成分细胞生长因子中至少两种，美白活性成分选自熊果苷、果酸、茴香酸、芦荟素。

上述载有活性成分的海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球制备方法，包括如下步骤：

（1）将Ι型胶原溶解在酸性介质中，加入海藻酸钠及活性成分混合形成均一胶体溶液，并脱除气泡；

（2）将上述胶体溶液挤压至二价阳离子溶液中形成初级微球；

（3）初级微球置于壳聚糖酸溶液中进一步固化得到载有活性成分的海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球。

上述步骤（1）中，酸性介质为有机或无机酸，其pH是1-4。制备得到的胶体溶液中海藻酸钠浓度为0.1-10 %，Ι型胶原浓度是0.1-20 %（优选为0.5-10 %），活性成分浓度为0.5-20 %（优选为1-10 %）。

上述步骤（2）中，二价阳离子选自Ba²⁺，Ca²⁺，Co²⁺，Zn²⁺，Mn²⁺，Ni²⁺，二价阳离子溶液质量百分比浓度为0.1-10 %。将胶体溶液转移至连有气体注射泵的玻璃针筒中，调节注射泵速度将混合物挤压至二价阳离子溶液中，通过凝胶作用形成初级微球。

上述步骤（3）中，壳聚糖酸溶液是将壳聚糖溶于甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、抗坏血酸、草酸、丁二酸、丙二酸、脂肪酸、丙酮酸、戊二酸、酒石酸、天冬氨酸、水杨酸或乙醇酸溶液中得到，壳聚糖的浓度为0.1-10 %，壳聚糖的分子量为2-30万。

上述载有活性成分的海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球可用于化妆品中，使用时，将载有活性成分的海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球在溶媒中溶胀后使用，所述溶媒为丁二醇和透明质酸的水溶液，pH为6.0-6.8，其中丁二醇的浓度为2%。

使用本发明方法制得的微球表面光滑圆整，单分散性好，粒径分布均一，具有快速溶胀性质，其直径分布系数可控制在20%以内，直径可在50-1500μm内自由调节，其30s溶媒中的溶胀度＞200%。

直径分布系数={[(di-d)²/N]^1/2/d}×100%  （1）

溶胀度=[(m_t-m₀)/m₀]×100%            （2）

式(1)中，di为各个微球的直径，d为数平均直径，N为计算直径的微球数量，N＞200；式(2)中，m_t是微球在t时刻的质量（g）； m₀是干燥后微球的质量（g）。

本发明采用高生物相容性和低免疫原性的海藻酸钠、壳聚糖以及胶原为载体，通过自组装静电吸附法对化妆品中的多种不同功效活性成分进行包覆制备得到海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球，具有以下优点：

（1）制备方法中未添加有毒的有机溶剂、交联剂和乳化剂等，因此最终的微球中没有残留有毒物质，做到了真正的零污染；

（2）一种微球载体同时包载多种不同功效化妆品活性成分，实现了同一化妆品兼备不同功效的特点，满足了多功能护理用品的需求；

（3）微球与溶媒搭配使用，方便快捷，即用即配，活性成分及时释放，提高了活性成分的利用度；

（4）制备方法工艺简单、成本低、温和环保，市场前景广阔。

附图说明

图1 微球制备工艺流程图。

图2 实施例1微球照片。

图3 实施例2制备的微球的光学显微镜照片。

图4实施例4微球扫描电镜图。 

图5实施例1- 4的微球粒径分布图，（A）实施例1制备的微球的粒径分布图（粒径分布系数为17.85%）,（B）实施例2制备的微球的粒径分布图（粒径分布系数为18.23%）,（C）实施例3制备的微球的粒径分布图（粒径分布系数为18.77%）,（D）实施例4制备的微球的粒径分布（图粒径分布系数为19.05%）。

图6 功效验证—试验组合对照组不同指标变化对比趋势图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，本发明所述浓度均为质量百分比浓度，实验测定仪器：扫描电子显微镜JSM5800，激光粒度仪COULTER LS200。

本发明制备包载多种化妆品活性成分的海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球的方法，包括以下步骤：将经过纯化的胎牛皮I型胶原溶解在pH值为1-4的酸性介质中，在4-10℃下与海藻酸钠以及活性成分相混合形成均一胶体溶液，超声除去气泡，其中：胶原的浓度范围为0.1-20 %，海藻酸钠的浓度范围为0.1-10%，化妆品活性成分(除了细胞生长因子)的浓度范围为0.5-20 %，细胞生长因子的浓度范围为0.1-10μg/ml。

将上述混合胶体溶液转移至连有气体注射泵的玻璃针筒中，针筒内的气体可以是氮气、氦气、氩气、二氧化碳和空气中的任意一种，针筒内的气体流速可以通过注射泵来控制，这样可以形成不同尺寸的微球。

将混合物通过气体注射泵进行挤压，混合物克服黏滞力和表面张力，从针孔以液滴状进入氯化钙溶液中，通过凝胶作用形成初级微球，凝胶作用时间5-20min，抽滤后收集微球。溶液中的阳离子可以是Ba²⁺,Ca²⁺,Co²⁺,Zn²⁺,Mn²⁺, Ni²⁺中的任意一种，通常选用Ca²⁺来进行凝胶化，本发明中二价阳离子的浓度为0.1-10 %。

将上述初级微球转移至浓度为0.1-10%的壳聚糖溶液中进一步固化，固化时间5-30min，壳聚糖溶液的pH值在4.0-6.5之间，用来溶解壳聚糖的酸包括甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、抗坏血酸、草酸、丁二酸、丙二酸、脂肪酸、丙酮酸、戊二酸、酒石酸、天冬氨酸、水杨酸、乙醇酸中的至少一种。

用去离子水洗涤微球2-3遍，微球内的胶原进行重组，海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球形成。本步骤是在室温进行，洗涤过后的微球经冷冻干燥后保存。冻干后的微球可以和溶媒搭配使用，将活性成分安全有效地输送到皮肤肌层。

实施例1：粒径为1500μm的负载美白成分熊果苷和高保湿成分神经酰胺的海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球

1、如图1所示，将30mg 胎牛皮I型胶原溶解在6ml pH值为3.5的乙酸水溶液中，加入2.0ml 6%的海藻酸钠，10ml 浓度为6 mg/ml的熊果苷以及10ml 浓度为1mg/ml神经酰胺混合均匀，超声30s除去气泡。

2、将混合溶液转移至连有气体注射泵（型号A-99，Razel科学仪器公司）的玻璃针筒中，外部有一根管子将氮气瓶和泵连接，控制泵的气流速度为5 ml/min的氮气，在1 %氯化钙溶液中固化6min，初级微球形成。为了防止胶原变性，本步骤是在4℃进行的。

3、将分子量为30万的壳聚糖溶于0.05%的乙酸得到壳聚糖质量百分比浓度为1.0 %的溶液，其pH为 5.5，将步骤2中的初级微球转移至壳聚糖溶液中进一步固化，交联固化时间为5min，本步骤是在室温进行的。

4、用去离子水洗涤微球2-3遍，海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球形成。对微球进行粒径分析，制备的微球粒径在1480±50μm（图2、5）。然后微球经过冷冻干燥后保存。

5、将冻干后的微球置于溶媒中进行溶胀，在30s溶胀度达到247%。 其中溶媒是丁二醇和透明质酸的水溶液，pH为6.5，丁二醇的浓度为2%。

6、通过将微球冻干、称重，得到海藻酸钠、壳聚糖、Ι型胶原和活性成分的重量比约为：120：105：30：70。

实施例2：粒径为500μm的负载美白成分熊果苷和高保湿成分神经酰胺的海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球

按照实施例1中的条件进行，将步骤2中的控制泵的气流速度由5 ml/min改为7.5 ml/min。对微球进行粒径分析，制备的微球粒径在505±20μm（图3、5）。将冻干后的微球置于溶媒中进行溶胀，在30s溶胀度达到315%。

实施例3：粒径为1500μm的负载三种活性成分的海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球

三种活性成分分别是美白成分熊果苷、保湿成分神经酰胺、抗衰老成分表皮细胞生长因子EGF

步骤1：将30mg经过纯化的胎牛皮I型胶原溶解在6ml pH值为3.5的乙酸溶液中， 2.0ml 8%的海藻酸钠，10ml浓度为6mg/ml的熊果苷、10ml浓度为1mg/ml神经酰胺、2ml浓度为1μg/ml的EGF（表皮细胞生长因子）混合均匀，超声30s除去气泡。

其余步骤和实施例1相同。通过将微球冻干、称重，得到海藻酸钠、壳聚糖、Ι型胶原和活性成分的重量比约为：160：140：30：70。

对微球进行粒径分析，制备的微球粒径在1490±50μm（图5）。将冻干后的微球置于溶媒中进行溶胀，在30s溶胀度达到268%。

实施例4：粒径为50μm的负载三种活性成分的海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球

三种活性成分分别是指美白成分熊果苷、保湿成分神经酰胺、抗衰老成分表皮细胞生长因子EGF

按照实施例3中的条件进行，将步骤2中的控制泵的气流速度由5 ml/min改为12 ml/min。对微球进行粒径分析，制备的微球粒径在53±9μm（图5）。将冻干后的微球置于溶媒中进行溶胀，在30s溶胀度达到367%。

实施例5：负载三种活性成分熊果苷、神经酰胺、表皮细胞生长因子EGF的海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球功效评价

受试对象：20位无皮肤敏感史的年龄在25-30岁的年轻女性，前臂内侧2cm ×2cm区域为受试部位，一侧为试验区，一侧为对照区

使用方法：将复合微球和溶媒搭配使用，涂抹在前臂内侧同一位置，具体使用方法为，取2-3颗微球于掌心，滴加两滴溶媒于微球上，等待30s左右，待微球充分溶胀后用食指和中指轻柔至球体破裂，然后均匀涂抹于前臂，早晚各一次。持续使用30天。

测试时间：从第1天开始，每隔两天进行一次皮肤测试，测试过程由皮肤科医生全程监控。

测试指标：包括角质层水合度、黑色素和皮肤弹性。

角质层水合度采用德国CK公司CM825型水分测试仪接触式连续测量方式进行。皮肤颜色采用德国CK公司MEXAMETER MX16黑色素测定仪进行测定。黑色素值通过仪器测出，平均测定3次取平均值，测量范围是0~999，测量数值越高，说明皮肤中黑色素含量越高。皮肤弹性采用SME575 弹性测试仪进行观测，平均测定3次取平均值，用R₂值表示( 拉伸/ 回弹比值)。

具体测定结果见表1，变化趋势见图6，结果表明，在连续使用负载三种不同功效的活性成分微球（等搭载溶媒）后，皮肤的综合指标均有显著变化，角质层水合度平均提高了46.8个点，黑色素也比对照组降低了49.3个点，同时皮肤弹性比对照组增加了16.3%。因此，负载不同功效的活性成分微球完全可以满足多功能护理用品的需要。