2-N7-硝基苯-2-乙二酸,3-4羟氨基-2-脱氧葡萄糖的合成方法

摘要

本发明提供了2-N[7-硝基苯-2-乙二酸,3-4羟氨基]-2-脱氧葡萄糖的合成方法，它具有如下操作步骤：取氨基葡萄糖盐酸盐、碱、4-氯-7-硝基苯呋咱，在反应溶剂中，10-60℃下反应15-20h，待反应结束后，除去溶剂，经硅胶柱层析，即得2-NBDG；所述反应溶剂为DMF、甲醇、含水甲醇、乙醇、甲苯中的一种或两种以上的混合；所述碱为碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾或三乙胺。本发明通过对合成方法的优选，在使用价格低廉的NBD-Cl为原料时，就能够保证较高的2-NBDG的收率，极大地节省了生产成本，且该反应条件温和，操作简便，为2-NBDG的工业化生产提供了基础，为降低2-NBDG的昂贵售价提供了可能，具有良好的工业应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及2-NBDG的合成方法，即2-N[7-硝基苯-2-乙二酸,3-4羟氨 基]-2-脱氧葡萄糖的合成。

背景技术

2-NBDG，即2-N[7-硝基苯-2-乙二酸,3-4羟氨基]-2-脱氧葡萄糖，是2- 脱氧葡萄糖(2-DG)荧光类似物，是一种常用的生化荧光试剂，目前多将其应 用于疾病检测中的光学成像技术，特别是用于对肿瘤的检测（胡慧，等，江 苏大学学报（医学版），2010年20卷3期，p216~219）。该化合物在成像技 术方面具有优异效果，但其市面售价较高，约为5mg/2000元，目前还无法 大量投入使用。

2-NBDG的制备方法，是导致其高售价的主要原因。目前报道的2-NBDG 的合成方法，主要分为两种：

方法一、通过NBD-Cl和GlcN反应来合成2-NBDG

2007年Yamada,K.报道了的合成2-NBDG的方法，这是目前报道的通过 NBD-Cl来合成2-NBDG较为理想的方法。其合成步骤如下：

该方法收率仅有12%，收率较低导致了2-NBDG的高售价。（Yamada,K.; Saito,M.;Matsuoka,H.;Inagaki,N.Nat.Protoc.2007,2,753–762.）

方法二、通过NBD-F和GlcN反应来合成2-NBDG

2011年在Jung,M.E.报道的文章中[Tetrahedron Letters 52(2011)2533-2535]，首次利用NBD-F来合成2-NBDG，其收率有了明显的 提高，其合成方法为：

（一）、

将NBD-F(48.7mg,0.266mmol,1.1equiv)和氨基葡萄糖盐酸盐（52.4 mg 0.243mmol,1.0 equiv)加入到1mL乙腈中，然后加入0.3M NaHCO₃(0.315mmol,1.2equiv)溶液1ml，然后在黑暗的环境下将混合液在23°C条 件下搅拌28h后溶液变为了红黑色/黑色。待反应结束后用硅藻土过滤，用甲 醇洗，滤液旋干、用硅胶柱层析，最后得到红色粉末状产物(62mg,75%)。

（二）、

将NBD-F(52.1mg,0.285mmol,1.0equiv)和氨基葡萄糖盐酸盐(64.5 mg,0.299mmol,1.1equiv)加入到圆底烧瓶中，然后加入0.5mL DMF和三乙 胺(0.08mL,0.569mmol,2.0equiv)。然后在黑暗的环境下将混合液在23°C 条件下搅拌28h，待反应结束后将混合物真空浓缩，用硅胶柱层析，最后得 到红色粉末状产物(63.2mg,65%)。

该方法中，采用NBD-F为原料进行合成，2-NBDG的收率可高达 65%-75%，显著提高了产品收率。然而，该方法中使用的NBD-F，其价格昂 贵，其市场售价大约是NBD-Cl的100倍以上，使得该方法的制备成本显著 提高，这也是导致2-NBDG昂贵的另一个原因；同时，NBD-F见光容易分解， 不容易保存，最好是现制现用，而且反应要在避光的条件下进行，不便于工 业化大生产。

因此，寻求一条更加经济、简便、高效的方法来合成2-NBDG仍然具有 其研究价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的2-N[7-硝基苯-2-乙二酸,3-4羟氨基]-2- 脱氧葡萄糖的合成方法。

本发明提供了2-NBDG的合成方法，其操作步骤如下：

取氨基葡萄糖盐酸盐、碱、4-氯-7-硝基苯呋咱，在反应溶剂中，20-60 ℃下反应15-20h，待反应结束后，除去溶剂，经硅胶柱层析，即得目标产物；

所述反应溶剂为DMF、甲醇、含水甲醇、乙醇、甲苯中的一种或两种以 上的混合溶剂；所述碱为碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾或三乙胺。

反应式如下：

进一步地，所述反应溶剂为DMF、甲醇或浓度大于40%v/v的含水甲醇。

进一步优选地，所述反应溶剂为甲醇。

进一步优选地，所述碱为三乙胺。

进一步地，反应温度为28-32℃。

进一步优选地，反应温度为30℃。

进一步地，反应时间为15-20h。

进一步优选地，反应时间为15-16h。

其中，碱与4-氯-7-硝基苯呋咱的摩尔比为（2.2-3.5）：1。

进一步地，碱与4-氯-7-硝基苯呋咱的摩尔比为3：1。

其中，氨基葡萄糖盐酸盐与4-氯-7-硝基苯呋咱的摩尔比为（1-1.5）：1。

进一步地，氨基葡萄糖盐酸盐与4-氯-7-硝基苯呋咱的摩尔比为1.2：1。

本发明通过对合成方法的优选，在使用价格低廉的NBD-Cl为原料时， 就能够保证较高的2-NBDG的收率，极大地节省了生产成本，且该反应 条件温和，操作简便，为2-NBDG的工业化生产提供了基础，为降低 2-NBDG的昂贵售价提供了可能，具有良好的工业应用前景。

具体实施方式

实施例1本发明2-NBDG的合成方法

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(1293mg,6mmol,1.2equiv)加入到圆底烧瓶中，然 后加入15ml甲醇和三乙胺(1515mg,15mmol,3equiv),将反应混合物在30°C 条件下搅拌1h，然后加入NBD-Cl(997.5mg,5mmol,1equiv)和甲醇15ml， 继续在30°C条件下反应15h，反应混合物逐渐变为黑绿色。待反应结束后， 将反应液定容至50ml的容量瓶中，然后在HPLC中进样10μl，平行进样三 次，根据峰面积的平均值采用外标法计算收率，收率为82.4%。待反应结束 后，真空浓缩除去甲醇，然后用(DCM:MeOH)硅胶柱层析，最后得到红色 粉末状产物，计算收率，收率也可以达到80%。

对上述粉末状产物进行鉴定，结果表明，该产物为2-NBDG，其结构式 如下：

具体数据如下：

高分辨质谱：(C₁₂H₁₄N₄O₈+Na)⁺m/z 365.0704,found m/z 365.0710.

¹HNMR(300MHz,D₂O):δ:8.53(1H,d,J=9.43),8.48(1H,d,J=9.30), 6.62(1H,d,J=9.19),6.55(1H,d,J=9.15),5.50(1H,s),4.98(1H,d,J=7.51), 4.10(2H,t,J=9.10),3.84-3.99(8H,m),3.36-3.67(4H,m)

收率的计算方法：

收率=实际质量/理论质量×100%

含量检测方法采用HPLC进行，色谱条件如下：

C18柱(250mm×4.6mm,10μm)，流动相为甲醇-水(10:90)，流速1.0 ml·min~(-1)，检测波长474nm，进样量10μl。

实施例2本发明2-NBDG的合成方法

在100ml圆底烧瓶中依次加入氨基葡萄糖盐酸盐(1293mg,6mmol, 1.2equiv)、30ml甲醇、三乙胺(1515mg,15mmol,3equiv)和NBD-Cl(997.5mg, 5mmol,1equiv)，在30°C条件下搅拌反应16h，反应混合物逐渐变为黑绿色。 待反应结束后，将溶液定容至50ml的容量瓶中，然后在HPLC中进样10μl， 平行进样三次，根据峰面积的平均值采用外标法计算收率，收率为80.4%。 待反应结束后，真空浓缩除去甲醇，然后用(DCM:MeOH)硅胶柱层析，最 后得到红色粉末状产物，计算收率，收率达到78.4%。

实施例3本发明2-NBDG的合成方法

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(51.72mg,0.24mmol,1.2equiv)加入到圆底烧瓶 中，然后加入2ml甲醇和三乙胺(60.6mg,0.6mmol,3equiv),将反应混合物在 30°C条件下搅拌1h，然后加入NBD-Cl(39.9mg,0.2mmol,1equiv)，继续在 30°C条件下反应15h，反应混合物逐渐变为黑绿色。待反应结束后，将混 合物真空浓缩除去甲醇，(DCM:MeOH)硅胶柱层析，最后得到红色粉末状产 物(53.6mg,78.4%)。

实施例4本发明合成方法的工艺考察

1、不同反应时间的筛选

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(51.72mg,0.24mmol,1.2equiv)加入到圆底烧瓶 中，然后加入750μl水和NaHCO3(50.4mg,0.6mmol,3equiv)，将反应混合 物在20°C条件下搅拌1h，然后加入NBD-Cl(39.9mg,0.2mmol,1equiv)和甲 醇1ml。继续在20°C条件下反应不同的时间，反应混合物逐渐变为黑绿色， 待反应结束后，将反应液定容至10ml的容量瓶中，然后在HPLC中进样10 μl，平行进样三次，根据峰面积的平均值采用外标法计算收率。同时，我们 采用硅胶柱层析的方法验证了Table1(Entry 2、3)的收率。待反应结束后，用 二氯甲烷萃取三次，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤、旋干、(DCM: MeOH)硅胶柱层析，最后得到红色粉末状产物，计算收率，收率分别为20.3% 和18.3%。如此证明采用HPLC的方法测定2-NBDG的收率是可行的。

表1.时间筛选结果

  实验编号   1   2   3   4   5   6   时间/h   8   15   20   24   30   36   收率/％   16.2   24.3   22.3   15.0   14.4   10.6

2、碱的种类筛选

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(51.72mg,0.24mmol,1.2equiv)加入到圆底烧 瓶中，然后加入750μl水和不同的有机与无机碱(3equiv)，在20°C条件下 搅拌1h，然后加入NBD-Cl(39.9mg,0.2mmol,1equiv)和甲醇1ml，继续 在20°C条件下反应15h，反应混合物逐渐变为黑绿色。继续搅拌，待反应 结束后，将反应液定容至10ml的容量瓶中，然后在HPLC中进样10μl，平 行进样三次，根据峰面积的平均值采用外标法计算收率。

表2.碱的种类筛选结果

3、碱的不同用量的筛选

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(51.72mg,0.24mmol,1.2equiv)加入到圆底烧 瓶中，然后加入750μl水和不同当量的TEA，在20°C条件下搅拌1h，然 后加入NBD-Cl(39.9mg,0.2mmol,1equiv)和甲醇1ml，继续在20°C条件 下反应15h，反应混合物逐渐变为黑绿色，待反应结束后，将反应液定容至 10ml的容量瓶中，然后在HPLC中进样10μl，平行进样三次，根据峰面积的 平均值采用外标法计算收率。

表3.碱的用量筛选结果

  实验编号   1   2   3   4   5   6   7   TEA：NBD-Cl   1.2   1.6   2.2   2.6   3   3.5   4   收率/％   5.3   6.8   25.4   32.7   40.6   26.4   少量

4、不同溶剂的筛选

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(51.72mg,0.24mmol,1.2equiv)加入到圆底烧 瓶中，然后加入750μl水和TEA(60.6mg,0.6mmol,3equiv)，在20°C条 件下搅拌1h，然后加入NBD-Cl(39.9mg,0.2mmol,1equiv)和不同的有机 溶剂1ml，继续在20°C条件下反应15h，反应混合物逐渐变为黑绿色，待反 应结束后，将反应液定容至10ml的容量瓶中，然后在HPLC中进样10μl， 平行进样三次，根据峰面积的平均值采用外标法计算收率。

表4.溶剂种类筛选结果

  实验编号   1   2   3   4   5   6   7   溶剂   DMF   甲醇   乙醇   丙酮   甲苯   EtOAc   乙腈   收率/％   33.7   40.6   22.4   18.7   23.8   16.3   18.3

5、溶剂比例的筛选

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(51.72mg,0.24mmol,1.2equiv)加入到圆底烧 瓶中，然后加入溶剂A(750μl)和TEA(60.6mg,0.6mmol,3equiv)，在20°C 条件下搅拌1h，然后加入NBD-Cl(39.9mg,0.2mmol,1equiv)和溶剂 B(1ml)，继续在20°C条件下反应15h，反应混合物逐渐变为黑绿色，待反 应结束后，将反应液定容至10ml的容量瓶中，然后在HPLC中进样10μl， 平行进样三次，根据峰面积的平均值采用外标法计算收率。

表5.溶剂比筛选结果

6、不同反应温度的筛选

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(51.72mg,0.24mmol,1.2equiv)加入到圆底烧 瓶中，然后加入甲醇1ml和TEA(60.6mg,0.6mmol,3equiv)，在不同温度 条件下搅拌1h，然后加入NBD-Cl(39.9mg,0.2mmol,1equiv)和甲醇1ml， 继续在该温度下反应15h，反应混合物逐渐变为黑绿色，待反应结束后，将 反应液定容至10ml的容量瓶中，然后在HPLC中进样10μl，平行进样三次， 根据峰面积的平均值采用外标法计算收率。

表6.温度筛选结果

  实验编号   1   2   3   4   5   6   温度   0℃   10℃   20℃   30℃   40℃   60℃   收率//％   2.7   28.6   60.2   83.0   65.3   50.2

通过上述筛选实验，得出本发明的最佳工艺为：

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(1293mg,6mmol,1.2equiv)加入到圆底烧瓶中， 然后加入15ml甲醇和三乙胺(1515mg,15mmol,3equiv),将反应混合物在30°C 条件下搅拌1h，然后加入NBD-Cl(997.5mg,5mmol,1equiv)和甲醇15ml， 继续在30°C条件下反应15h，待反应结束后，将混合物真空浓缩除去甲醇， (DCM:MeOH)硅胶柱层析，最后得到2-NBDG。

结论：

（1）与背景技术中提及的“方法一”相比，本发明在该合成方法 的基础上，对反应条件、催化剂、溶剂等作进一步优化，使得2-NBDG 的收率提高了550%以上。

（2）与背景技术中提及的“方法二”相比，本发明仅使用价格低廉的 NBD-Cl为原料，就能得到与方法二相当甚至更高的收率，使得原料成 本降低了100倍以上，极大地节约了生产成本，其原料价格对比参见下 表。

表7NBD-Cl与NBD-F的市场售价比较（价格：人民币元）

  商家1   商家2   商家3   商家4   平均售价   NBD-Cl   5g/524   5g/798,1g/199   5g/618   5g/977   1g/148   NBD-F   100mg/1630   100mg/2486   -   100mg/1480   1g/18653

综上所述，本发明通过对合成方法的优化，在使用价格低廉的NBD-Cl 为原料时，就能够保证较高的2-NBDG的收率，极大地节省了生产成本，且该 反应条件温和，操作简便，为2-NBDG的工业化生产提供了基础，为降低2-NBDG 的昂贵售价提供了可能，具有良好的工业应用前景。