一种从小果博落回中提取分离六种二氢苯并菲啶类生物碱的方法

摘要

本发明公开了一种从小果博落回中提取分离六种二氢苯并菲啶类生物碱的方法，该方法是将小果博落回原料经过溶剂提取、浓缩、分离、纯化，得到6‑(2’‑甲酸乙酯基)二氢血根碱、6‑(2’‑羧酸乙酯基)二氢白屈菜红碱，6‑羧酸甲酯基二氢血根碱，6‑羧酸乙酯基二氢血根碱，6‑(2’‑羧酸乙酯基)二氢血根碱和6‑异羧酸乙酯二氢血根碱；该方法从小果博落回中成功提取分离出六种二氢苯并菲啶类生物碱，提取分离效率高，且获得的生物碱纯度高，提高了小果博落回的资源化利用，为对新药物活性成分的认知研究和提取分离提供有效途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从小果博落回中提取生物碱的方法，具体涉及从小果博落回(Macleaya microcarpa(Maxim.)Fedde)中分离提纯4个新二氢苯并菲啶类生物 碱6-(2’-甲酸乙酯基)二氢血根碱、6-羧酸甲酯基二氢血根碱，6-羧酸乙酯基 二氢血根碱，6-异羧酸乙酯二氢血根碱和2个已知二氢苯并菲啶类生物碱(6-(2’- 羧酸乙酯基)二氢白屈菜红碱和6-(2’-羧酸乙酯基)二氢血根碱)的方法，属 于天然药物提取分离领域。

背景技术

小果博落回系罂粟科博落回属植物，多年生大型草本植物，主要分布于河南、 陕西、贵州、四川等省区。在自然状态下，生长于海拔500至1500米的山坡、 河边或沟岸。小果博落回中主要存在的活性成分为生物碱类，具有抗菌、抗炎、 镇痛、改善肝功能、调节肠道菌群等功效。小果博落回的化学成分复杂，活性成 分分离困难，目前对于测定小果博落回中生物碱含量的报道较多，而很少有分离 具体高纯生物碱的报道。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种从小果博落回茎叶 中同时分离4个新二氢苯并菲啶类生物碱和2个已知二氢苯并菲啶类生物碱的方 法，该方法可以高效获得六种高纯度二氢苯并菲啶类生物碱，实现了天然药物资 源的综合利用，为寻找新的药物活性成分提供有效的途径。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种从小果博落回中提取分离六种二 氢苯并菲啶类生物碱的方法，其包括以下步骤：

1)将小果博落回原料经过乙醇溶液进行冷浸动态提取，过滤分离，得到浸 提液I和浸提渣；浸提液I经过减压回收乙醇溶液；浸提渣采用回收的乙醇溶液 进行回流浸提，得到浸提液II，浸提液II经过减压浓缩，得到浸膏；

2)将浸膏与硅胶拌匀后，依次采用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯进行提取， 所得提取液分别浓缩，得到石油醚浸膏、二氯甲烷浸膏和乙酸乙酯浸膏；

3)所述二氯甲烷浸膏与硅胶混合装柱，以石油醚-乙酸乙酯体系进行洗脱， 同时采用TLC薄层色谱和质谱跟踪检测，收集含目标组分的馏分，经过浓缩干 燥后，采用液相色谱分离，得到6-(2’-甲酸乙酯基)二氢血根碱和6-(2’-羧酸 乙酯基)二氢白屈菜红碱；

4)所述乙酸乙酯浸膏采用乙酸乙酯-甲醇体系及石油醚-乙酸乙酯体系进行 洗脱，同时采用TLC薄层色谱和质谱跟踪检测，收集含目标组分的馏分，经过 浓缩干燥后，采用液相色谱分离，得到6-羧酸甲酯基-二氢血根碱、6-羧酸乙酯 基-二氢血根碱、6-(2’-羧酸乙酯基)二氢血根碱和6-异羧酸乙酯二氢血根碱。

优选的方案，将小果博落回原料切碎后，采用乙醇溶液进行冷浸动态提取 50～70h，过滤分离，得到浸提液I和浸提渣；浸提液I在35～45℃减压回收乙醇 溶液；浸提渣采用回收的乙醇溶液进行回流浸提1～3h，得到浸提液II，浸提液 II在55～65℃减压浓缩，得到浸膏。在对小果博落回原料提取过程中需分两步进 行，第一步采用高浓度95％乙醇溶液冷浸动态提取，冷浸动态提取不包含目标生 物碱成分，主要在于破坏植物细胞结构，有利于后续回流提取，而第二步采用回 流浸提，回流浸提过程采用浓度相对较低65～75％乙醇溶液，在回流提取条件下 可以最大程度提取小果博落回原料中目标生物碱。而且提取过程中乙醇溶液得到 充分循环使用，减少溶剂的耗量。

优选的方案，所述小果博落回原料包括新鲜小果博落回的茎和叶。

优选的方案，冷浸动态提取过程中乙醇溶液为质量百分比浓度为95％乙醇。

优选的方案，回流浸提过程采用的乙醇溶液为质量百分比浓度为65～75％的 乙醇。回流浸提的温度一般在75～85℃温度范围内。

优选的方案，将浸膏与等质量硅胶进行搅拌后，加入石油醚，静置提取10～30min，收集上层清液，即提取液，在40～60℃减压回收石油醚，回收的石油醚再 次用于提取，直至最终所得提取液颜色呈浅绿色，减压回收石油醚，得石油醚浸 膏；再依次采用二氯甲烷和乙酸乙酯按照石油醚的提取过程进行提取，分别获得 二氯甲烷浸膏和乙酸乙酯浸膏。小果博落回提取物中的成分复杂，通过采用极性 依次增大的有机溶剂来对有效成分实现初步分离富集。

优选的方案，所述二氯甲烷浸膏与硅胶混合装柱，先以石油醚-乙酸乙酯体 系进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯的体积比＝10:1、5:1和1:1，同时采用TLC 薄层色谱和质谱跟踪检测，收集主要含目标组分的馏分，进行浓缩，所得浸膏再 以石油醚-乙酸乙酯体系进行等梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯的体积比＝5:1，收 集主要含目标组分的馏分，浓缩干燥，所得浸膏进行液相色谱分离。二氯甲烷浸 膏采用石油醚-乙酸乙酯体系作为洗脱剂，梯度V/V＝10:1，5:1，1:1，选用100～200 目硅胶作为填充材料(250×1000mm)，每500mL洗脱剂作为一个馏分，共收集 226个馏分，根据薄层色谱(TLC)及紫外显色(254nm或365nm)合并相似 馏分，减压回收溶剂，共得到16个组分(E1～E16)，通过检测目标组分主要存 在于E9，E9再使用300～400目硅胶作为填充材料(50×300mm)，用石油醚-乙 酸乙酯体系作为洗脱剂，进行等梯度洗脱(V/V＝5:1)，每25mL作为一个馏分， 共收集76个馏分，根据薄层色谱及紫外显色(254nm或365nm)合并相似馏分， 回收溶剂，得到组分E9-1至E9-10，通过检测发现目标组分主要存在于E9-5。 E9-5采用液相色谱分离。

优选的方案，步骤3)中，液相色谱参数：色谱仪：Agilent 1260-DAD；色 谱柱：Agilent ZORBA SB-C18，9.4×250mm，5μm；洗脱液为：流动相B为0.1％ (质量百分比)甲酸乙腈，流动相A为0.1％(质量百分比)甲酸水，流速：3mL/min， 等度洗脱：0～15min，B：65vol％，A：35vol％。E9-5通过液相色谱分离直接 可以获得高纯度6-(2’-甲酸乙酯基)二氢血根碱和6-(2’-羧酸乙酯基)二氢白 屈菜红碱。

优选的方案，所述乙酸乙酯浸膏采用乙酸乙酯-甲醇体系进行梯度洗脱，乙 酸乙酯与甲醇的体积比＝50:1、20:1、10:1、5:1和1:1，同时采用TLC薄层色谱 和质谱跟踪检测，收集主要含目标组分的馏分，进行浓缩，所得浸膏再以石油醚 -乙酸乙酯体系进行等梯度洗脱，石油醚和乙酸乙酯的体积比＝3:1；收集主要含 目标组分的馏分，进行浓缩，所得浸膏再以石油醚-乙酸乙酯体系进行等梯度洗 脱，石油醚和乙酸乙酯的体积比＝2:1，收集主要含目标组分的馏分，进行浓缩， 所得浸膏进行液相色谱分离。乙酸乙酯浸膏先采用100～200目硅胶作为填充材料， (90×500mm)，先采用乙酸乙酯-甲醇体系作为洗脱剂，洗脱梯度V/V＝50:1，20:1，10:1，5:1和1:1，进行梯度洗脱，每100mL为一个馏分，共收集234个馏分，根据薄层色谱(TLC)及紫外显色(254nm或365nm)合并相似馏分，减压回 收溶剂，共得到9个组分(F1～F9)。通过检测在F1中发现同分异构体。将F1 采用300～400目硅胶作为填充材料(50×300mm)，以石油醚-乙酸乙酯体系作为 洗脱剂，进行等梯度洗脱(V/V＝3:1)，每50mL洗脱剂为一个馏分，共收集165 个馏分，根据TLC及紫外显色(254nm或365nm)合并相似馏分，减压回收溶 剂，共得到12个组分(F1-1到F1-12)。经检测发现几个同分异构体主要集中在 F1-2(0.93g)，继续分离F1-2，选用300-400目硅胶(20×160mm)，以石油醚- 乙酸乙酯V/V＝5:1作为洗脱剂，每10mL为一个馏分，共收集53个馏分，根据 薄层色谱(TLC)及紫外显色(254nm或365nm)合并相似馏分，减压回收溶 剂，共得到8个组分(F1-2-1到F1-2-8)，通过检测发现同分异构体主要集中在 F1-2-3(168mg)。采用色谱继续分离F1-2-3。

优选的方案，步骤4)中，色谱仪：Agilent 1260-DAD；色谱柱：Agilent ZORBA SB-C18，4.6×250mm，5μm；洗脱液：流动相B为0.1％(质量百分比)甲酸乙 腈和流动相A为0.1％(质量百分比)甲酸水，流速：1mL/min，梯度洗脱程序 为：0min，B：10vol％，A：90vol％；5～45min，B：58vol％，A：42vol％； 50～55min，B：90vol％，A：10vol％；55.1～60min，B：10vol％，A：90vol％。 F1-2-3通过色谱分离得到6-羧酸甲酯基二氢血根碱、6-羧酸乙酯基二氢血根碱、 6-异羧酸乙酯二氢血根碱和6-(2’-羧酸乙酯基)二氢血根碱。

本发明的石油醚浸膏主要起脱色素作用同时仅包含极少量待分离的目标组 分，可以直接回收溶剂后废弃处理。

相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益效果：

本发明首次以小果博落回作为原料通过提取分离纯化，得到4个新二氢苯并 菲啶类生物碱：6-(2’-甲酸乙酯基)二氢血根碱、6-羧酸甲酯基二氢血根碱、 6-羧酸乙酯基二氢血根碱、6-异羧酸乙酯二氢血根碱，以及2个已知二氢苯并菲 啶类生物碱6-(2’-羧酸乙酯基)二氢白屈菜红碱和6-(2’-羧酸乙酯基)二氢血 根碱，提高了小果博落回的资源化利用，为新活性成分的认知研究和提取分离提 供有效途径。

本发明从小果博落回中提取分离出六个高纯度二氢苯并菲啶类生物碱，且对 二氢苯并菲啶类生物碱提取分离效率高。

附图说明

【图1】为分离的6-(2’-甲酸乙酯基)二氢血根碱的HPLC图谱。

【图2】为分离的6-(2’-甲酸乙酯基)二氢血根碱的质谱TIC图谱。

【图3】为分离的6-(2’-甲酸乙酯基)二氢血根碱的质谱二级图谱。

【图4】为分离的6-(2’-甲酸乙酯基)二氢血根碱的¹H-¹HCOSY图谱(400MHz，>3)。

【图5】为分离的6-(2’-甲酸乙酯基)二氢血根碱的HSQC图谱(400MHz，in CDCl₃)。

【图6】为分离的6-(2’-甲酸乙酯基)二氢血根碱的HMBC图谱(400MHz，in CDCl₃)。

【图7】为分离的6-(2’-甲酸乙酯基)二氢血根碱的DEPT135图谱(400MHz，>3)。

【图8】为分离的6-(2’-羧酸乙酯基)二氢白屈菜红碱的HPLC图谱。

【图9】为分离的6-(2’-羧酸乙酯基)二氢白屈菜红碱的质谱TIC图谱。

【图10】为分离的6-(2’-羧酸乙酯基)二氢白屈菜红碱的质谱¹H-¹HCOSY图>

【图11】为分离的6-(2’-羧酸乙酯基)二氢白屈菜红碱的质谱DEPT135图谱。

【图12】为分离的6-羧酸甲酯基二氢血根碱的HPLC、TIC和二级质谱图谱。

【图13】为分离的6-羧酸乙酯基二氢血根碱的HPLC、TIC和二级质谱图谱。

【图14】为分离的6-(2’-羧酸乙酯基)二氢血根碱的HPLC和二级质谱图谱。

【图15】为分离的6-异羧酸乙酯二氢血根碱的HPLC、TIC和二级图谱。

【图16】为本发明的工艺流程图。

具体实施方式

以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护 范围。

实施例1

提取：将新鲜小果博落回茎叶(水分含量约76.33％)切碎，常温下用800L 95％乙醇进行浸提60h，过滤得到乙醇浸提液，40℃减压回收溶剂(乙醇浓度 约为72％)，得到水溶液(约45L)，残渣部分用回收溶剂80℃，进行回流提取 2h，得到回流提取液，回流提取液60℃进行减压浓缩得到3kg浸膏。

富集：将浸膏加入等量硅胶(3kg，100-200目)进行搅拌，混匀成粉末状， 先加入石油醚约7.5L，进行充分搅拌，后静置20min，收集上清液，50℃进行 减压回收，回收的石油醚再次进行提取，每次加入石油醚2.5L，共提取10次， 直至提取溶液颜色呈浅绿色，减压回收溶剂，得石油醚浸膏。后依次用二氯甲烷、 乙酸乙酯进行提取，方法同石油醚提取，通过检测目标成分主要集中在二氯甲烷 浸膏及乙酸乙酯浸膏中。

分离：二氯甲烷浸膏选择使用石油醚-乙酸乙酯10:1，5:1，1:1进行梯度洗 脱，选用100-200目硅胶作为填充材料(250×1000mm)，每500mL作为一个 馏分，共收集226个馏分，根据薄层色谱(TLC)及紫外显色(254nm或365nm) 合并相似馏分，减压回收溶剂，共得到16个组分(E1-E16)。通过HPLC-Q/TOF MS检测发现m/z为406.1293和436.1777的目标化合物主要存在于E9，使用硅 胶柱(300-400目，50×300mm)继续分离组分E9，用石油醚-乙酸乙酯(5:1) 洗脱，每25mL作为一个馏分，共收集76个馏分，根据薄层色谱及紫外显色(254 nm或365nm)合并相似馏分，回收溶剂，得到组分E9-1至E9-10。通过 HPLC-Q/TOF MS检测发现m/z为406.1293和436.1777的目标化合物主要存在于 E9-5，使用Agilent 1260-DAD(AgilentZORBA SB-C18，9.4×250mm，5μm) 分离组分E9-5，用0.1％甲酸乙腈和0.1％甲酸水(65:35，v/v)，流速3mL/min 等度洗脱，检测波长285.4nm(图3)，获得化合物6-(2’-甲酸乙酯基)-二氢 血根碱和6-(2’-羧酸乙酯基)-二氢白屈菜红碱。

用硅胶柱(100-200目，90×500mm)分离乙酸乙酯浸膏，用乙酸乙酯-甲醇50:1，20:1，10:1，5:1和1:1进行梯度洗脱，每100mL为一个馏分，共收集234个馏 分，根据薄层色谱(TLC)及紫外显色(254nm或365nm)合并相似馏分，减 压回收溶剂，共得到9个组分(F1-F9)。通过HPLC-Q/TOF MS检测在F1中发 现m/z为406.1293和420.1459的同分异构体。F1采用300-400目硅胶作为填充 材料(50×300mm)，以石油醚-乙酸乙酯3:1为洗脱剂，每50mL为一个馏分， 共收集165个馏分，根据TLC及紫外显色(254nm或365nm)合并相似馏分， 减压回收溶剂，共得到12个组分(F1-1到F1-12)。经HPLC-Q/TOF MS检测发 现几个同分异构体主要集中在F1-2(0.93g)，继续分离F1-2，选用300-400目 硅胶(20×160mm)，以石油醚-乙酸乙酯5:1作为洗脱剂，每10mL为一个馏分， 共收集53个馏分，根据薄层色谱(TLC)及紫外显色(254nm或365nm)合并 相似馏分，减压回收溶剂，共得到8个组分(F1-2-1到F1-2-8)，通过检测发现 同分异构体主要集中在F1-2-3(168mg)。采用色谱继续分离F1-2-3，色谱柱为Agilent ZORBA SB-C18(4.6×250mm,5μm)，流动相为0.1％甲酸乙腈(B)和 0.1％甲酸水(A)，检测波长为285.4nm，流速：1mL/min，梯度洗脱程序为0min， B：10％；5-45min，B：58％；50-55min，B：90％；55.1-60min，B：10％，获 得化合物6-羧酸甲酯基二氢血根碱、6-羧酸乙酯基二氢血根碱、6-异羧酸乙酯二 氢血根碱和6-(2’-羧酸乙酯基)二氢血根碱。

纯化：分别浓缩6-(2’-甲酸乙酯基)二氢血根碱、6-(2’-羧酸乙酯基)二 氢白屈菜红碱、6-羧酸甲酯基二氢血根碱、6-羧酸乙酯基二氢血根碱、6-异羧酸 乙酯二氢血根碱和6-(2’-羧酸乙酯基)二氢血根碱馏分。6-(2’-甲酸乙酯基) 二氢血根碱得19.8mg(纯度86％；色谱图如图1所示)；6-(2’-羧酸乙酯基) 二氢白屈菜红碱得13.9mg(纯度92％；色谱图如图8所示)；6-羧酸甲酯基二氢 血根碱得0.74mg(纯度95％；色谱图如图12所示)；6-羧酸乙酯基二氢血根碱 得1.2mg(纯度95％；色谱图如图13所示)；6-(2’-羧酸乙酯基)二氢血根碱 得0.86mg(纯度95％；色谱图如图14所示)；6-异羧酸乙酯二氢血根碱得0.91mg (纯度95％；色谱图如图15所示)。