一种磁珠-PNA探针复合物及富集肝癌循环肿瘤DNA的应用

摘要

本发明公开了一种磁珠‑PNA探针复合物及富集肝癌循环肿瘤DNA的应用，将待测样本与磁珠‑PNA探针复合物杂交反应使待测样本中未突变基因与磁珠‑PNA探针复合物结合形成靶DNA‑磁珠‑PNA探针复合物，磁分离，获得含突变基因的上清；PCR无差别扩增含突变基因的上清后构建突变基因文库并采用分选磁珠纯化突变基因文库，再与捕获探针杂交反应，杂交产物加入捕获磁珠，使突变基因结合到捕获磁珠中，经过洗脱分离，获得肝癌循环肿瘤DNA。本发明较未经磁珠‑PNA探针复合物处理组在肝癌循环肿瘤DNA的检测灵敏度上提高了10倍以上。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种富集肝癌循环肿瘤DNA中P53基因突变的方法。

(二)背景技术

肝癌是我国第二大癌症死因，目前肝癌的早期诊疗薄弱，缺乏准确和灵敏的预警和早诊标志物，该状况导致超过60％的肝癌患者在初次就诊时就已进入中晚期，从而失去手术根治的机会。更为严峻的是，对肝癌而言即使早期癌灶也可有高转移潜能，其高复发率与肿瘤大小、生物学特性、侧枝循环及栓塞技术、栓塞方式和程度等有关(尤其对于巨块型肝癌，周围常伴有影像学难以显示的微卫星灶及微血管侵犯，导致临床上所谓的“肝癌根治性手术”本质上却属于姑息性切除，术后的残癌细胞可获得转移潜能，引起复发、局部转移或远隔器官转移)。为尽可能早期发现残癌或复发，为患者争取适宜的、有效的治疗时机，需要能精确监测肿瘤进展的有效的手段，这也是当前国内外学者研究的主要方向。

循环肿瘤DNA检测技术近年来正逐渐成为国际上具重大潜力的肿瘤诊断新技术。据估算，目前影像学检测肿瘤的最小阈值为10亿个癌细胞，而外周血中循环肿瘤DNA的检测下限则为1千万个癌细胞，灵敏度提高了100倍[Regalado A.Spotting cancer in a vialof blood.MIT Technology Review.2014.]。对于其他常见肿瘤，当前针对肝癌循环肿瘤DNA检测技术的开发还很欠缺，面临着至少两个关键障碍：(1)肝癌循环肿瘤DNA在血液中的浓度极低，并有其它更高浓度的循环DNA的干扰；(2)肝癌基因变异(包括点突变、删除、插入、扩增、DNA修饰等)信息复杂而目前已知的信息不全面，检测的灵敏度及准确率限制了循环肿瘤DNA诊断肝癌的可行性[JiaCheng Tang,YiLi Feng,Tao Guo,AnYong Xie,XiuJunCai.Circulating tumor DNA in hepatocellular carcinoma:Trends andChallenges.Cell Biosci.2016；6:32.]。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种磁珠-PNA探针复合物及在富集肝癌循环肿瘤DNA中的应用，该方法可明显提高含P53 747G>T突变的循环肿瘤DNA含量(富集效果在10倍以上)，克服了目前高通量测序平台因自身仪器错误率在检测突变丰度上的技术瓶颈，同时有效降低测序深度，节约了测序成本，使循环肿瘤DNA中P53基因(747G>T)突变检测有望成为肝癌患者的预警、预防、早诊及预后监测的辅助指标，并为其治疗过程中靶向药物选择及耐药性进化等研究提供可能的借鉴。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种磁珠-PNA探针复合物，所述复合物是由磁珠与PNA探针结合而成，所述磁珠包被链霉亲和素；所述PNA探针的核苷酸序列为：5’-AAC CGG AGG CCC ATC CT-3’，在5’端进行生物素标记。所述PNA探针是以P53基因为模板设计。

进一步，所述磁珠以10mg/ml磁珠缓冲液悬液的形式加入，磁珠粒径为1.05μm。

进一步，所述磁珠缓冲液悬液按如下方法制备：将装有包被链霉亲和素的磁珠溶液(赛默飞公司，商品号：65001)的EP管置磁分离架上静置1分钟，弃上清，用1×Bindingand Washing(B&W)缓冲液洗涤磁珠三次后以2×B&W缓冲液重悬，即为磁珠缓冲液悬液；所述重悬用2×B&W缓冲液体积以磁珠重量计为50ul/0.5mg；所述2×B&W缓冲液组成为：10mMTris-HCl，1mM EDTA，2M NaCl，溶解于超纯水，pH＝7.5。

进一步，所述磁珠-PNA探针复合物按如下方法制备：取PNA探针水溶液于99℃变性10分钟，4℃静置5分钟后，与磁珠缓冲液悬液混合，室温杂交15分钟，置磁分离架上静置3分钟，弃上清，磁珠用1×B&W缓冲液洗涤(优选3次)以除去未结合的探针，即得到磁珠-PNA探针复合物；所述PNA探针水溶液与磁珠缓冲液悬液体积比为1:1，所述PNA探针水溶液是将PNA探针用超纯水制成20pmol/ul的PNA探针水溶液；所述磁珠缓冲液悬液由2×B&W缓冲液制成，其中磁珠包被有链霉亲和素，所述磁珠含量为10mg/ml。

本发明还提供一种磁珠-PNA探针复合物在富集肝癌循环肿瘤DNA中的应用，所述应用的方法为：将待测样本与磁珠-PNA探针复合物杂交反应使待测样本中未突变基因与磁珠-PNA探针复合物结合形成靶DNA-磁珠-PNA探针复合物，磁分离，获得含突变基因的上清；PCR无差别扩增含突变基因的上清后构建突变基因文库并采用分选磁珠纯化突变基因文库，再与捕获探针杂交反应，杂交产物加入捕获磁珠中，使突变基因结合到捕获磁珠中，经过洗脱分离，获得突变基因，即肝癌循环肿瘤DNA；所述捕获探针核苷酸序列为：5’-AAC CGGAGT CCC ATC CT-3’；所述突变基因是指P53基因(747G>T)突变。

进一步，所述应用的方法为：(1)复合物靶向结合非突变基因：将待测样本于99℃变性10分钟，4℃静置5分钟后，加入磁珠-PNA探针复合物和杂交液构成反应体系，50℃杂交1小时后，静置磁分离2分钟，获得靶DNA-磁珠-PNA探针复合物和含突变基因的上清，实现非突变基因的捕获；所述待测样本与磁珠-PNA探针复合物体积比为1:1；所述杂交液补足至反应体系100μL；所述杂交液组成：150mM NaCl，15mM柠檬酸钠，0.02％Tween-20，溶解于超纯水，pH＝7.0；

(2)突变基因文库的构建：以步骤(1)中含突变基因的上清为模板，以P53-F和P53-R为引物进行PCR反应，并采用全能型DNA建库试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司，商品号：12200ES08)将PCR产物建库，获得突变基因文库；

P53-F：TTTTCGACATAGTGTGGT；

P53-R：GTCCCAGTAGATTACCACT；

(3)突变基因的捕获：将步骤(2)突变基因文库经分选磁珠纯化后，加入捕获探针(序列为：5’-AAC CGG AGT CCC ATC CT-3’)，涡旋震荡混匀后于杂交炉中95℃孵育5分钟，再于47℃孵育16至20小时，利用寡核苷酸分子杂交技术获得杂交产物；将杂交产物利用磁珠捕获突变基因，纯化，获得肝癌循环肿瘤DNA。

进一步，步骤(3)所述突变基因的捕获方法为：首先采用试剂盒中的分选磁珠纯化突变基因文库，优选采用靶向富集(HyperCap Target Enrichment)试剂盒，具体实验操作流程严格按照罗氏公司官方说明书SeqCap EZ HyperCap Workflow User’s Guide,v2.3：取1μg上述突变基因文库与5μl HyperCap通用封闭寡核苷酸(HyperCap UniversalBlocking Oligos)和5μg COT人DNA(COT Human DNA)(均为罗氏公司试剂盒中提供，商品号：08286370001)混匀，加入上述混合物总体积两倍体积的室温预混匀的分选磁珠(AMPureXP Beads)(罗氏公司，商品号：08286418001)，涡旋震荡混匀10秒后孵育10分钟，磁分离后去上清并缓慢加入190μl浓度80％乙醇超纯水溶液洗涤一次后，加入7.5μl 2×杂交缓冲液(Hybridization Buffer)和3μl杂交组分A(Hybridization Component A)混合液(罗氏公司，商品号：05634261001)，涡旋震荡混匀，室温孵育2分钟，磁分离后取上清10.5μl，即为含突变基因的溶液；其次杂交产物进行捕获：向10.5μl分选磁珠纯化后的含突变基因的溶液中加入4.5μl0.67pmol/μl捕获探针水溶液，涡旋震荡混匀后于杂交炉中95℃孵育5分钟，47℃孵育16至20小时，加入50μl捕获磁珠Capture Beads(罗氏公司，商品号：08286418001)，杂交炉中47℃孵育15分钟；加入100ul 1×磁珠洗涤缓冲液(Bead Wash Buffer)(罗氏公司，商品号：05634261001)磁分离后弃上清，再加入200μl 1×严谨性洗涤缓冲液(Stringent Wash Buffer)(罗氏公司，商品号：05634261001)，混匀后47℃孵育5分钟，磁分离后弃上清；重复一次加入200μl 1×Stringent Wash Buffer，混匀后47℃孵育5分钟，磁分离后弃上清；加入200μl 1×Wash Buffer I(罗氏公司，商品号：05634261001)，涡旋震荡混匀后磁分离至上清澄清后弃上清，加入200μl 1×Wash Buffer II(罗氏公司，商品号：05634261001)，涡旋震荡混匀后磁分离至上清澄清后弃上清，加入200μl 1×Wash BufferIII(罗氏公司，商品号：05634261001)，涡旋震荡混匀，磁分离至上清澄清后弃上清，加入15μl超纯水，获得清洗后含突变基因的磁珠悬液。

进一步，步骤(3)突变基因纯化方法为：(1)向20μl(含15μl超纯水)清洗后含突变基因的磁珠水悬液中加入25μl 2×Super II高保真酶预混液(SuperIIHigh-Fidelity Mix)(上海翊圣生物科技有限公司，商品号：12200ES08)和P53-F、P53-R引物(10μM)各2.5μl，完成捕获后LM-PCR反应(Post-Capture LM-PCR)，获得扩增产物；(2)向上述50μl扩增产物中加入90μl分选磁珠AMPure XP Beads(罗氏公司，商品号：08286418001)，震荡混匀，静置5min，磁分离至上清澄清后弃上清，缓慢加入200μl新鲜配置的浓度80％乙醇超纯水溶液洗两次；室温静置5min，至磁珠表面呈现无光泽，加入53μl超纯水，用移液器吹打混匀，室温静置2min，磁分离至上清澄清后，取上清，即为富集后的突变基因，即肝癌循环肿瘤DNA。

本发明通过在检测肝癌循环肿瘤DNA前增加一步捕获靶向(未突变)DNA的过程，有效的消减了背景DNA的干扰(变向增加了肿瘤DNA的浓度)，从而提高了肝癌循环肿瘤DNA(即突变DNA)的检测灵敏度。通过该方法我们于术后1个月即检测到受检者血浆中游离DNA中P53基因747G>T突变(常规的检查方法则会将窗口后移3～6个月)，预示该肝癌病人有潜在复发可能，在后期的影像学复查中，这一推测得到证实。肝动脉化疗栓塞术(TACE)后的检测结果显示该患者的外周血中仍有较高的循环肿瘤DNA P53基因747G>T突变系数，提示该患者远期疗效容易反复，与后期随访的病程描述相符。

通过这一创新，可期通过抽血检测即可：(1)在普通人群中灵敏、快速、准确、无创、低成本地进行的肝癌筛查，帮助完成肝癌的预警、预防和早诊；(2)对P53747G>T突变的肝癌病人灵敏、快速、准确、无创、低成本地进行术后的预后分析，为完善该类肿瘤病人的治疗提供依据。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明提供一种磁珠-PNA探针复合物，利用该复合物将待测样本中未突变的DNA吸附去除后，经PCR反应、构建突变基因文库，定向捕获探针捕获后，减少了正常循环DNA的干扰，明显增高含P53 747G>T突变的循环肿瘤DNA的相对含量，较未经磁珠-PNA探针复合物处理组在肝癌循环肿瘤DNA的检测灵敏度上提高了10倍以上，使针对肝癌循环肿瘤DNA的检测成为可能。

(四)附图说明

图1是实施例2二步法富集和检测肝癌循环肿瘤DNA中P53基因突变方法的原理图，其中利用PNA探针捕捉对照(未突变)序列，再利用捕获测序检测P53突变序列(747G>T)。

图2是实施例3利用二步法富集和检测技术分别检测以不同模板拷贝数比例(WT：MT＝10⁷：10⁵；10⁷：10⁴；10⁷：10³；10⁷：10²)混合物中P53基因747G>T的突变序列；A为测序数据质量评估、过滤和产出统计柱状图；B为将过滤后的测序数据比对到基因组数据库中确定样品中的SNP位点及突变系数。

图3是实施例4患者不同时期肝脏影像图及肝癌组织p53基因测序结果图；A1为患者术前CT图，A2为患者术前MR图；B1为患者术后半年复查CT图，B2为患者术后半年复查MR图；C为患者行TACE治疗时的肝动脉造影图；D为肝癌患者术中留取的肿瘤标本p53基因测序结果图。

图4是实施例4循环肿瘤DNA与肝癌患者体内肿瘤细胞数量相关性的示意图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述LB培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，溶剂为去离子水，pH自然，并进行高压蒸气灭菌。

所述室温是指25-30℃，所述超纯水是指电阻率达到18MΩ*cm(25℃)的水。

实施例1：P53基因突变位点的选择及引物设计

1、PNA探针和IDT捕获探针的设计

从目前已公开的肝癌病人DNA测序数据(综合The Cancer Genome Atlas和Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer数据库)中选取已明确的癌症活化驱动突变，按照突变频率高低排序，其中代表性突变：P53：747G>T；TERT：124C>T；CTNNB1：121A>G等。由于肝癌中P53基因(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)第747位碱基的突变频率在肝癌患者中大于10％，在我国更是占肝癌患者P53突变的80％以上，远高于其他基因的突变频率，因此针对P53基因设计PNA探针(探针序列为SEQ ID NO.2)：5’-AAC CGG AGG CCC ATCCT-3’，在5’端进行生物素标记)和捕获探针(核苷酸序列为SEQ ID NO.3)：5’-AAC CGG AGTCCC ATC CT-3’)，见图1。

2、P53野生型质粒(WT)购买自ORIGENE公司，商品号：RC200003。

3、P53 747G>T突变型质粒(MT)的构建：

以步骤2中P53野生型质粒为模板，根据P53 747G>T突变位点设计引物(表1)并交由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成，使用定点突变试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司，商品号：11003ES10)构建P53基因747G>T突变型质粒，即将SEQ ID NO.1所示P53基因第747为G突变为T。

表1.构建P53 747G>T突变型质粒的引物

将引物稀释至10μM，依次加入以下试剂(均为试剂盒中提供)后进行PCR扩增反应：

表2. PCR反应体系

表3. PCR反应条件

因上述扩增产物中包含原始模板质粒，为防止其在转化后形成假阳性转化子，必须在进行重组环化之前进行DpnI消化。因此将扩增后的产物中加入1μL DpnI酶，于37℃恒温反应2小时，获得DpnI消化后的产物。

取一新的无菌的1.5ml Eppendorf管于冰水浴中，依次加入下列组分(表4)并小心混匀。

表4.重组反应体系

50℃反应20min后，立即将反应管置于冰水浴中冷却。加入到100μl E.coli DH5α感受态细胞(上海翊圣生物科技有限公司，商品号：11802ES80)中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30分钟；42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2分钟；加入900μl LB培养基，37℃孵育10分钟充分复苏；37℃，200rpm-250rpm，摇菌45分钟；取100μl菌液均匀涂布在含100ng/ml氨苄霉素的LB平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。

挑取单克隆于含100ng/ml氨苄霉素的LB培养基中扩增过夜后使用高纯度质粒小提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，商品号：DP104-02)提取质粒DNA并以p53-SEQF和p53-SEQR为引物进行测序鉴定突变位点，测序结果表明P53基因747G>T突变型质粒构建成功，按照1ng上述质粒约含有5.5×10⁸拷贝数的换算关系计算拷贝数用于后续实验。

p53-SEQF(5’→3’)：AAACCTACCAGGGCAGCTACG；

p53-SEQR(5’→3’)：CCCAGCCTGGGCATCCTT。

实施例2：评估深度测序技术在检测P53基因747G>T突变频率中的阈值

1、由于目前Agilent、Illumina等主流测序平台均认为测序结果中0.1％及以下的突变频率不可信，因此我们将P53野生型质粒(WT)和747G>T突变型质粒(MT)分别按照以下模板拷贝数比例(WT：MT＝10⁷：10⁵；10⁷：10⁴；10⁷：10³；10⁷：10²)混合，模拟1％～0.001％的突变频率。因为绝大部分肝癌循环肿瘤DNA的长度为120-220bp，且表达量的峰值约在166bp左右，故本实例中将扩增长度为167bp的对照(野生型)片段和突变片段。

扩增对照片段和突变片段的方法如下：将野生型(WT)质粒与突变型(MT)质粒按比例(WT：MT＝10⁷：10⁵；10⁷：10⁴；10⁷：10³；10⁷：10²)混合后行高保真PCR反应，引物、反应液及反应条件见表5、表6和表7，其中模板为野生型质粒和突变型质粒各稀释至1μl后混合而成。

表5. PCR反应的引物

表6. PCR反应液配制(南京诺唯赞生物科技有限公司，商品号：P503-d1)

表7. PCR反应条件

将各个比例的PCR扩增产物行电泳并割胶回收(167bp位置)，具体方法见胶回收试剂盒说明(凯杰公司，商品号：28704)。使用Nanodrop分光光度计测定扩增产物浓度。

2、参见全能型DNA建库试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司，商品号：12200ES08)说明书将回收产物建库，具体操作步骤如下：

(1)取割胶回收产物50μl于PCR管，加入10μl Endprep Mix(试剂盒中提供)，涡旋震荡混匀。30℃孵育20分钟，72℃孵育20分钟。反应完成后于冰上保存。

(2)向步骤(1)产物中加入30μl Ligation Enhancer、5μl Fast T4DNA Ligase和5μl DNA Adapter(均为试剂盒中提供)，涡旋震荡混匀。其中DNA Adapter的终浓度据表8进行调整，使用超纯水补齐至总体积100μl。

表8. Adapter的终浓度与模板DNA量的换算关系

模板DNA量/ngAdapter的终浓度/μM1000155001525015100155015257.510351.52.50.7510.3

(3)20℃孵育15分钟后，室温加入80μl分选磁珠(DNASelectionBeads，0.8×，Beads:DNA＝0.8:1，试剂盒中提供)，混匀后室温静置5分钟。将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离分选磁珠和液体，待溶液澄清后去上清。

(4)保持PCR管始终置于磁力架中，缓慢加入200μl新鲜配制的体积浓度80％乙醇超纯水溶液，室温孵育30秒后，用移液器吸去上清。重复一次步骤(4)，获得结合了DNA的分选磁珠。

(5)室温静置5分钟至分选磁珠表面无光泽。加入21μl超纯水，用移液器吹打混匀，室温静置5分钟，获得纯化后的DNA溶液，即为基因文库。

(6)使用Agilent生物分析仪对基因文库进行质检(参见安捷伦2100生物分析仪操作说明)。文库检测合格(即峰型单一，无弥散、拖尾等文库峰图)后，将上述文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina HiSeq测序。

(7)应用生物信息学软件对测序结果进行分析。测序结束后，测序仪会生成原始基因序列文件，此文件最常见的格式是FASTQ，需要对原始序列文件进行生物信息学分析和处理，过滤掉无效数据，随后获取测序样本的序列信息，报告突变位点，并计算等位基因突变频率。以上过程需要借助生物信息分析软件来完成，即用Picardtools进行数据过滤生成sam文件，并且用Samtools(version 1.3)重新进行排序，最后，将所有样本的sam文件进行call SNP处理，获得单核苷酸变异信息。经上述处理后在WT：MT＝10⁷：10⁵实验组中，统计序列总读取数为20237485，有效读取数为19932219，其中存在P53基因747G>T突变位点的读取数为175571(在后期分析时我们将所有测序结果归一化处理并统一以突变系数SNP>7：10⁵实验组中SNP>7：10⁴的实验组中，总序列读取数为17010310，有效读取数为16820607，但因P53基因747G>T突变的读取数值过小且SNP>

综上，最后确定以Illumina Hiseq常规测序能检测出的突变片段与野生型片段比例的最低值为：WT：MT＝10⁷：10⁵(即1％的突变频率)。

实施例3：二步法富集和检测P53基因747G>T突变的敏感性测试

以实施例2中相同的突变型质粒与野生型质粒比例(即：WT：MT＝10⁷：10⁵；10⁷：10⁴；10⁷：10³；10⁷：10²)，通过二步法富集后进行P53基因突变的敏感性检测。首先利用链霉亲和素包被的磁珠富集与PNA探针杂交的P53基因正常序列(即靶向DNA)，然后通过捕获探针捕获突变基因(即肝癌循环肿瘤DNA)，具体操作步骤如下：

1、配置20pmol/μl PNA探针水溶液：取实施例1中PNA探针(探针序列为：5’-AACCGG AGG CCC ATC CT-3’，在5’端进行生物素标记)于EP管，用100μl超纯水溶解，50℃加热促溶。再用超纯水稀释至Nanodrop分光光度计下测定浓度，即为20pmol/μl。

20pmol/μl捕获探针水溶液：将捕获探针(5’-AAC CGG AGT CCC ATC CT-3’)于EP管，用100μl超纯水溶解，50℃加热促溶。再用超纯水稀释至Nanodrop分光光度计下测定浓度，即为20pmol/μl。

2、磁珠缓冲液悬液的准备：将含50μl(0.5mg)包被链霉亲和素磁珠(赛默飞公司，商品号：65001)的EP管置磁分离架上静置1分钟，弃上清，用1×Binding andWashing(B&W)缓冲液洗涤磁珠三次后以2×B&W缓冲液50ul重悬，即为10mg/ml磁珠缓冲液悬液。所述2×B&W缓冲液组成为：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，2MNaCl，溶解于超纯水，pH＝7.5。

3.磁珠-PNA探针复合物的制备：取50ul步骤1配制的20pmol/ul的PNA探针缓冲液于99℃变性10分钟，于4℃静置5分钟后，与步骤2中0.01mg/ul磁珠缓冲液悬液50ul混合，室温杂交15分钟，置磁分离架上静置3分钟，弃上清，磁珠用1×B&W缓冲液洗3次以除去未结合的探针，加入50ul 2×B&W缓冲液重悬，即得到磁珠-PNA探针复合物悬液。

4、未突变DNA的去除：取实施例2步骤1中回收得到的各个PCR扩增产物50μl于99℃变性10分钟，4℃静置5分钟后，加入步骤3制备获得的磁珠-PNA探针复合物悬液50μl，用1×SSC-Tween杂交液(150mM NaCl，15mM柠檬酸钠，0.02％Tween-20，溶解于超纯水，pH＝7.0)补至总体积100μl，置杂交炉(购自美国UVP公司，型号HB1000)中50℃杂交1小时；对照管将磁珠-PNA探针复合物替换为同量超纯水，其他操作同实验管。杂交结束，各体系置于磁分离架上静置2分钟进行磁分离后，获得靶DNA-磁珠-PNA探针复合物，实现未突变基因的去除，留取含突变基因的上清待用。

5、构建突变DNA文库：将50μl上述留取的含突变基因的上清转移至无菌PCR管中进行扩增，PCR反应的引物(P53-F和P53-R)及条件如实施例2中表5-表7所示，其中具体循环数见表9。

表9. PCR模板DNA量与PCR循环数的换算关系

PCR模板DNA量/ng循环数0.512-13111-1258-9107-8505-61003-45001-2

以全能型DNA建库试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司，商品号：12200ES08)将PCR产物构建突变基因文库(获得突变基因文库)，操作方法同实施例2步骤2。用Qubit对步骤6突变基因文库进行定量(参见荧光计操作操作说明)。

6.突变基因的捕获：

实验操作流程严格按照罗氏公司官方说明书SeqCap EZ HyperCap WorkflowUser’s Guide,v2.3，取1μg上述突变基因文库与5μl HyperCap Universal BlockingOligos和5μg COT Human DNA(均为罗氏公司试剂盒中提供)混匀，加入上述混合物总体积的两倍体积的室温预混匀的分选磁珠AMPure XPBeads(罗氏公司，商品号：08286418001)，涡旋震荡混匀10秒后孵育10分钟，将突变DNA(即P53基因的747G>T突变基因)结合到分选磁珠AMPure XPBeads上；磁分离后去上清并缓慢加入190μl体积浓度80％乙醇超纯水溶液洗涤一次，获得结合了突变DNA的分选磁珠AMPure XPBeads。向结合了突变DNA的分选磁珠AMPure XPBeads加入7.5μl 2×Hybridization Buffer和3μlHybridization Component A混合液(罗氏公司，商品号：05634261001)，涡旋震荡混匀，室温孵育2分钟，解离突变DNA与分选磁珠AMPure XPBeads，磁分离后获得含突变DNA的上清。

含突变DNA的上清10.5μl加入4.5μl 0.67pmol/μl捕获探针水溶液(核苷酸序列为SEQ ID NO.3)，涡旋震荡混匀后于杂交炉中95℃孵育5分钟，47℃孵育16至20小时。再加入50μl捕获磁珠Capture Beads(罗氏公司，商品号：08286418001)，杂交炉中47℃孵育15分钟，将突变基因通过捕获探针结合到Capture Beads上。加入100μl 1×Bead Wash Buffer(罗氏公司，商品号：05634261001)，涡旋震荡混匀。将离心管置于磁力架上，至上清澄清后弃上清；获得结合了突变基因的Capture Beads。加入200μl 1×Stringent Wash Buffer(罗氏公司，商品号：05634261001)，混匀后47℃孵育5分钟，将离心管置于磁力架上后弃上清。重复一次添加1×Stringent Wash Buffer，磁分离后弃上清。加入200μl 1×WashBuffer I，涡旋震荡混匀。将离心管置于磁力架上，至上清澄清后弃上清。加入200μl 1×Wash Buffer II，涡旋震荡混匀，置于磁力架上，至上清澄清后弃上清。加入200μl 1×WashBuffer III(均为罗氏公司，商品号：05634261001)，涡旋震荡混匀，置于磁力架上，至上清澄清后弃上清。加入15μl超纯水，用移液器吹打混匀，获得了清洗后含突变基因的CaptureBeads。

7、突变基因的纯化：

(1)向步骤6含突变基因的Capture Beads(含15μl超纯水，总体积约20ul)中加入25μl 2×SuperII High-Fidelity Mix(上海翊圣生物科技有限公司，商品号：12200ES08)和P53-F、P53-R引物(10μM)各2.5μl震荡混匀，完成Post-Capture LM-PCR扩增(反应条件见表10)。

表10.Post-Capture LM-PCR反应条件

(2)向50μl PCR产物中加入90μl分选磁珠AMPure XPBeads(罗氏公司，商品号：08286418001)，震荡混匀，静置5min结合PCR产物。

(3)离心管置于磁力架上，至上清澄清后弃上清。缓慢加入200μl 80％乙醇超纯水溶液(操作时间≥30秒)，用移液器吸去上清。重复一次步骤(3)。

(4)室温静置5min，至磁珠表面呈现无光泽。加入53μl超纯水，用移液器吹打混匀，室温静置2min。将离心管置于磁力架上，至上清澄清后，将上清转移至新的离心管中。此时纯化的突变基因处于上清中。

(5)使用Agilent生物分析仪对突变基因进行质检(参见安捷伦2100生物分析仪操作说明)，检测合格(即峰型单一，无弥散、拖尾等文库峰图)后把上述突变基因按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina HiSeq测序。

如图2所示，通过BWA软件对原始数据进行质量预处理获取clean reads，通过划窗法去除3’端测序不准确的碱基，trim length设置为50bp(低于此长度的reads将被舍弃)结果见图2中A。每组样品读取两次后将clean reads比对到p53基因组上，以确定该reads在基因组上的位置并鉴定样品中的SNP位点，结果见图2中B。

通过二步法富集后，将突变片段与野生型片段按比例(即：WT：MT＝10⁷：10⁵；10⁷：10⁴；10⁷：10³；10⁷：10²)混合，采用实施例2方法通过P53基因747G>T突变的敏感性测试，显示最后确定能检测出的突变片段与野生型片段比例的最低值为：WT：MT＝10⁷：10³(0.01％)，较未经磁珠-PNA探针复合物富集处理的对照组提高了10倍。该技术利用二步法有效富集了待测突变，解决了目前捕获测序平台在检测突变丰度上的技术瓶颈，通过降低测序深度节约了测序成本，具一定的社会、经济效益。

实施例4：

1、病例描述：对于临床诊断为肝癌的患者，征得患者同意后术中收集肿瘤组织、癌旁组织标本。男性患者57岁，于2017年7月确诊为中分化肝细胞性肝癌后行肝左外叶切除术(术前肝部CT和MR图见图3中A1和A2)。术后定期复查，于2018年4月入院复诊检查后考虑为肝癌病灶(复查时肝部CT和MR图见图3中B1和B2)，行肠粘连松解+复杂左肝癌切除术。2018年7月行肝动脉化疗栓塞术(TACE治疗中肝动脉造影图，见图3中C)，出院后反复就诊，病情未见缓解。

2、二步法检测外周血循环肿瘤DNA中P53基因747G>T的突变频率

我们分别使用实施例3中二步法富集和检测了患者在不同时期(行肝左外叶切除术后1月、3月、6月(即2017年9月、11月及2018年4月)及行TACE后1月(即2018年8月))外周血循环肿瘤DNA中P53基因747G>T的突变频率，具体实验操作如下：

(1)外周血样本采集：以2％EDTA抗凝管采患者不同时期外周血10ml，全血样本以6000g离心30分钟，，取上层血浆作为外周血样本。

(2)外周血样本中游离DNA提取：采用MagMAX^TM游离DNA抽提试剂盒(赛默飞公司，商品号：A29319)，向离心管中依次加入1250ml游离DNA结合液、15μlDynal磁珠和1ml步骤(1)血浆，室温震荡10分钟使DNA与磁珠结合。将离心管置于磁力架上，待磁珠完全沉降后弃去上清。加入500ul游离DNA洗涤液，涡旋震荡混匀。将离心管置于磁力架上，待磁珠完全沉降后弃去上清。再次加入500uL>

(3)捕获未突变DNA：使用磁珠-PNA探针复合物吸附该上清中正常P53基因，操作方法同实施例3步骤1-步骤4，获得含突变基因的上清。

(4)突变DNA的扩增与定量：以P53-F和P53-R为引物对步骤(3)含突变基因的上清进行PCR扩增，操作方法同实施例3-步骤5。使用Qubit对步骤(3)DNA进行定量(参见荧光计操作操作说明)。

(5)构建突变基因文库：通过上海翊圣生物科技有限公司的全能型DNA建库试剂盒(商品号：12200ES08)对步骤(4)扩增产物构建突变基因文库，操作方法同实施例3步骤5。

(6)突变基因文库的捕获和检测：对得到的突变基因文库分选磁珠纯化、捕获、纯化并深度测序，操作方法同实施例3步骤6-步骤7。

通过对上述肝癌病人行肝左外叶切除术后1月、3月、6月(即2017年9月、11月及2018年4月)及行TACE后1月(即2018年8月)各个时间段的外周血样本，制备、纯化循环DNA(其中包括微量的肝癌循环肿瘤DNA)，以二步法富集和检测其中P53基因747G>T突变，将测序结果归一化处理后显示该患者在术后随访期间各个时间段均检测到外周血循环肿瘤DNA中P53基因747G>T的突变，其突变系数值依次为：11.07；19.73；27.02；65.79，总体呈上升趋势(术后6月该突变系数较其术后1月时增加了约2.5倍)，预示肿瘤有潜在复发的可能。

通过调取上述肝癌病人术后6月的影像学资料(结果见图3中B，肝IV段结节考虑肝癌，VIII段可疑结节癌待排，并于术后病理确认)，可知基于P53基因747G>T突变系数变化监测肝癌预后这一设想可行。同时，在术后1月时即检测到受检者血浆游离DNA中存在微量P53基因747G>T突变(突变系数为11.07)，揭示了该发明具有早诊残癌或复发，为患者争取治疗机会之意义。

TACE治疗本身客观存在缺陷，如残癌漏诊或延迟诊断、栓塞不完全、血管新生、化疗耐药等，致远期疗效欠佳。即使影像学显示介入栓塞治疗比较彻底，并不意味着肿瘤细胞完全灭活。此外，由于肝癌(特别是高分化、低度恶性结节)存在肝动脉和门静脉双重供血的可能，TACE术后不可避免残留癌灶，尤其是肝癌边缘部分由门静脉供血的病灶，是介入术后残癌或复发的主要来源。在本例患者行TACE(结果见图3中C)后1月时我们仍在其外周血中检测到较高的循环肿瘤DNA P53基因747G>T的突变系数，提示该患者虽经过TACE治疗后短期内病情好转，但远期疗效容易反复，后期随访显示该患者在TACE治疗出院后于多家医院反复就诊，皮肤、巩膜黄染，病情未见缓解。

图3中A1为患者术前肝部CT图，箭头所示左肝可见圆形低密度影，长径32mm，增强后强化明显。A2为患者术前肝部MR图，箭头所示左肝外叶约3.1×2.6cm团块影，界清光整，DWI呈高信号。肝中静脉后约7mm动脉期一过程性强化灶。考虑左肝外叶处肝癌。

图3中B1为患者术后半年复查CT图，虚线圈内所示左肝内叶近隔顶处见低密度结节约1.5cm，增强动脉期可见强化。B2为患者术后半年复查MR图，显示肝中静脉前后两处异常信号结节，大者约20mm，DWI呈高信号，肝胆期病灶为低信号影。考虑为肝癌病灶。

图3中C为患者取仰卧位行TACE治疗时的肝动脉造影图，以2％利多卡因局麻后，采用改良seldinger法，使用18G穿刺针经右股动脉穿刺，置于5F导管鞘，使用5F RH导管腹腔动脉造影。

图3中D为肝癌患者行肝左外叶切除术术中留取的肿瘤标本，该肿瘤标本经液氮急速冷冻后以Trizol法(赛默飞公司，商品号：15596026)提取RNA后逆转录为cDNA(伯乐公司，商品号：1708891)，以常规PCR扩增P53全长片段后测序，可见p53基因CDS区存在747G>T突变位点，正是前述二步法富集检测的SNP位点。

我们认为相比传统检测方法，本发明通过检测肝癌病人治疗前后循环肿瘤DNA中P53基因747G>T突变频率的变化，有望较影像学(CT/MRI)更早预判这部分肝癌患者的预后情况，其示意图见图4：该图表明无论在肝癌的早期病变还是晚期进展过程中，由肝癌细胞坏死、凋亡、微转移灶或循环肿瘤细胞的裂解和增殖旺盛的肿瘤细胞所释放进入外周血中的循环肿瘤DNA含量一直与患者体内肿瘤细胞的数量呈正相关，且在患者经历手术、放化疗等治疗后，循环肿瘤DNA含量都会呈现及时的反映。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种磁珠-PNA探针复合物及富集肝癌循环肿瘤DNA的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2591

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

gatgggattg gggttttccc ctcccatgtg ctcaagactg gcgctaaaag ttttgagctt 60

ctcaaaagtc tagagccacc gtccagggag caggtagctg ctgggctccg gggacacttt 120

gcgttcgggc tgggagcgtg ctttccacga cggtgacacg cttccctgga ttggcagcca 180

gactgccttc cgggtcactg ccatggagga gccgcagtca gatcctagcg tcgagccccc 240

tctgagtcag gaaacatttt cagacctatg gaaactactt cctgaaaaca acgttctgtc 300

ccccttgccg tcccaagcaa tggatgattt gatgctgtcc ccggacgata ttgaacaatg 360

gttcactgaa gacccaggtc cagatgaagc tcccagaatg ccagaggctg ctccccccgt 420

ggcccctgca ccagcagctc ctacaccggc ggcccctgca ccagccccct cctggcccct 480

gtcatcttct gtcccttccc agaaaaccta ccagggcagc tacggtttcc gtctgggctt 540

cttgcattct gggacagcca agtctgtgac ttgcacgtac tcccctgccc tcaacaagat 600

gttttgccaa ctggccaaga cctgccctgt gcagctgtgg gttgattcca cacccccgcc 660

cggcacccgc gtccgcgcca tggccatcta caagcagtca cagcacatga cggaggttgt 720

gaggcgctgc ccccaccatg agcgctgctc agatagcgat ggtctggccc ctcctcagca 780

tcttatccga gtggaaggaa atttgcgtgt ggagtatttg gatgacagaa acacttttcg 840

acatagtgtg gtggtgccct atgagccgcc tgaggttggc tctgactgta ccaccatcca 900

ctacaactac atgtgtaaca gttcctgcat gggcggcatg aaccggaggc ccatcctcac 960

catcatcaca ctggaagact ccagtggtaa tctactggga cggaacagct ttgaggtgcg 1020

tgtttgtgcc tgtcctggga gagaccggcg cacagaggaa gagaatctcc gcaagaaagg 1080

ggagcctcac cacgagctgc ccccagggag cactaagcga gcactgccca acaacaccag 1140

ctcctctccc cagccaaaga agaaaccact ggatggagaa tatttcaccc ttcagatccg 1200

tgggcgtgag cgcttcgaga tgttccgaga gctgaatgag gccttggaac tcaaggatgc 1260

ccaggctggg aaggagccag gggggagcag ggctcactcc agccacctga agtccaaaaa 1320

gggtcagtct acctcccgcc ataaaaaact catgttcaag acagaagggc ctgactcaga 1380

ctgacattct ccacttcttg ttccccactg acagcctccc acccccatct ctccctcccc 1440

tgccattttg ggttttgggt ctttgaaccc ttgcttgcaa taggtgtgcg tcagaagcac 1500

ccaggacttc catttgcttt gtcccggggc tccactgaac aagttggcct gcactggtgt 1560

tttgttgtgg ggaggaggat ggggagtagg acataccagc ttagatttta aggtttttac 1620

tgtgagggat gtttgggaga tgtaagaaat gttcttgcag ttaagggtta gtttacaatc 1680

agccacattc taggtagggg cccacttcac cgtactaacc agggaagctg tccctcactg 1740

ttgaattttc tctaacttca aggcccatat ctgtgaaatg ctggcatttg cacctacctc 1800

acagagtgca ttgtgagggt taatgaaata atgtacatct ggccttgaaa ccacctttta 1860

ttacatgggg tctagaactt gacccccttg agggtgcttg ttccctctcc ctgttggtcg 1920

gtgggttggt agtttctaca gttgggcagc tggttaggta gagggagttg tcaagtctct 1980

gctggcccag ccaaaccctg tctgacaacc tcttggtgaa ccttagtacc taaaaggaaa 2040

tctcacccca tcccacaccc tggaggattt catctcttgt atatgatgat ctggatccac 2100

caagacttgt tttatgctca gggtcaattt cttttttctt tttttttttt ttttttcttt 2160

ttctttgaga ctgggtctcg ctttgttgcc caggctggag tggagtggcg tgatcttggc 2220

ttactgcagc ctttgcctcc ccggctcgag cagtcctgcc tcagcctccg gagtagctgg 2280

gaccacaggt tcatgccacc atggccagcc aacttttgca tgttttgtag agatggggtc 2340

tcacagtgtt gcccaggctg gtctcaaact cctgggctca ggcgatccac ctgtctcagc 2400

ctcccagagt gctgggatta caattgtgag ccaccacgtc cagctggaag ggtcaacatc 2460

ttttacattc tgcaagcaca tctgcatttt caccccaccc ttcccctcct tctccctttt 2520

tatatcccat ttttatatcg atctcttatt ttacaataaa actttgctgc cacctgtgtg 2580

tctgaggggt g 2591

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

aaccggaggc ccatcct 17

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

aaccggagtc ccatcct 17