一种两亲性共聚物药物前体、制备方法以及包载钙泊三醇的纳米颗粒

摘要

本发明公开了一种含有7‑乙基‑10‑羟基喜树碱的两亲性共聚物药物前体，包括一段聚乙二醇作为亲水段和聚(7‑乙基‑10‑羟基喜树碱)及聚胆固醇作为疏水段；其中所述的聚(7‑乙基‑10‑羟基喜树碱)与聚胆固醇由羟基形成可降解化学键相连，所述的聚(7‑乙基‑10‑羟基喜树碱)和聚胆固醇均通过形成可降解化学键与聚乙二醇单甲醚骨架相连。本发明还公开了上述前体的制备方法以及包载钙泊三醇的纳米颗粒。本发明可以在水中自组装形成纳米颗粒的同时包载化合物钙泊三醇，提高了7‑乙基‑10‑羟基喜树碱和钙泊三醇在水中的溶解度，得到的纳米颗粒能够通过抑制星状细胞的活性，降低了细胞外基质，从而增加化疗药物的渗透和治疗效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种药物前体及其制备领域，具体涉及一种7-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体及其制备方法和应用。

背景技术

7-乙基-10-羟基喜树碱(简称SN-38)，是喜树碱的重要衍生物之一，其分子式为C22H20N2O5，分子量为392.31，CAS.NO：86639-52-3，结构式如下：

SN-38是喜树碱类抗癌药物中的一种。在临床上，喜树碱类药物中，已经批准使用的有伊立替康和拓扑替康，这两类药物是分别通过对SN-38、10-羟基喜树碱进行官能团修饰的方式得到的，改善了喜树碱类药物在水中的溶解性。SN-38是伊立替康在体内代谢得到的活性产物，它的药性在有些细胞株中，可以达到伊立替康的1000倍，但是，由于其极差的水溶性，使得其直接应用于体内受到限制。

癌症是危害人类健康的重要疾病，而许多致死率高的癌症的显著特点就是具有丰富并且致密的胶原基质(Sermour,A.B.；Hruban,R.H.；Redston,M.et al.Allelotype ofPancreatic Adenocarcinoma[J].Cancer Res,1994,54(10):2761-4.)，胶质中存在的生长因子、骨桥蛋白、骨膜素、酸性丝氨酸蛋白以及半胱氨酸都会对肿瘤细胞与细胞外基间的相互作用起到重要的调控作用，不仅促进了肿瘤细胞的转移并增强了肿瘤细胞的耐药性，而厚重的胶原基质阻碍了药物的渗透。

在肿瘤微环境中的众多细胞里，星状细胞是其中研究最为深入的细胞，对肿瘤微环境中分泌的胶质起到决定性作用(Hanahan,D.；Coussens,L.M.Accessories to thecrime functions of cells recruited to the tumor microenvironment[J].Cancercell,2012,21(3):309-22.)。而星状细胞存在两种状态，静息态和激活态：在人体正常的胰腺组织中，胰腺星状细胞通常以静息态存在，大概占人体胰腺正常实质细胞的4％-7％；激活态的星状细胞产生的致密胶原基质减小了药物的渗透能力(Netti,P.A.；Berk,D.A.；Swartz,M.A.et al.Role of extracellular matrix assembly in interstitialtransport in solid tumors[J].Cancer Res,2000,60(9):2497-503.)。

钙泊三醇是一种重要的维生素D衍生物，可以显著逆转星状细胞的激活状态，但其毒性强，副作用大，水溶性极低，化合物结晶性强，难以包载，且钙泊三醇本身的半衰期极短，只有4分钟，在人体中非常容易失活，代谢成为活性极差的两种代谢产物(Kragballe,K.Calcipotriol-a New Drug for Topical Psoriasis Treatment[J].PharmacolToxicol,1995,77(4):241-6.)。有研究表明钙泊三醇和化疗药物联合使用能增加化疗药物疗效(Sherman,M.H.；Yu,R.T.；Engle,D.D.et al.Vitamin D Receptor-Mediated Stromal Reprogramming Suppresses Pancreatitis and EnhancesPancreatic Cancer Therapy[J].Cell,2014,159(1):80-93.)。

申请号为CN200410048016的说明书公开了一种分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽及其药物结合物，该聚合物包含多个活性基团，通过这些基团衍生出线形聚乙二醇，最终形成多叉分支的聚乙二醇。

公开号为CN102060991A中公开了一种SN-38与短链PEG链接的药物，该药物具有非常高的细胞毒性。公开号为CN103251596A公开了一种7-乙基-10-羟基喜树碱的两亲性聚合物药物前体，包括一段聚乙二醇和一段聚(7-乙基-10-羟基喜树碱)；所述的聚(7-乙基-10-羟基喜树碱)是由7-乙基-10-羟基喜树碱上的10位或/和20位羟基通过可降解化学键与聚合物骨架相连，通过引入不同长度的聚乙二醇，使得该药物前体在水中自组装形成纳米颗粒，提高了7-乙基-10-羟基喜树碱在水中的溶解度。

发明内容

本发明提供了一种7-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体，该药物前体通过引入胆固醇，使得该药物前体易在水中溶解，从而高效包载钙泊三醇，使其具有很高的肿瘤毒性而对正常组织毒性较低。

所述的7-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体，包括一段聚乙二醇单甲醚作为亲水段和聚(7-乙基-10-羟基喜树碱)及聚胆固醇组成的疏水段，所述的聚(7-乙基-10-羟基喜树碱)和聚胆固醇均通过形成可降解化学键与聚乙二醇单甲醚骨架相连。

所述的7-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体中聚乙二醇单甲醚的数均分子量为550-20000，聚(7-乙基-10-羟基喜树碱)的数均分子量为600-60000，所述的聚胆固醇的数均分子量为600-60000。

所述的可降解化学键选自脲键、酯键、碳酸酯键、氨基甲酸酯键、磷酸酯键等体内可降解的化学键的一种或两种。

所述的可降解化学键为酯键时，所述的-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体是在缩合剂的作用下由7-乙基-10-羟基喜树与以一个或多个羧基为端基的聚乙二醇反应得到；所述的缩合剂选自N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲氨基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N,N’-二异丙基碳酰亚胺(DIPC)等中的一种。

作为优选，所述的7-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体(简称PEG-PSN-38-PCHL)，为如下式I所示结构的化合物:

式I中，所述聚乙二醇单甲醚的数均分子量为550-20000(x＝10-500)，聚(7-乙基-10-羟基喜树碱)的数均分子量为600-60000(y＝1-100)，所述的聚胆固醇的数均分子量为600-60000(z＝1-100)。

所述的7-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体，可自组装形成纳米颗粒(或称胶束或囊泡)。由于聚胆固醇段的加入，可高效包载钙泊三醇，因而可以在水性溶剂中自组装成包载钙泊三醇的纳米颗粒，其制备方法包括透析法、薄膜法、溶剂蒸发法等。

本发明还提供了一种7-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体的制备方法，产率高，方法简单，适合工业化生产。

所述的7-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体的制备方法包括：

(1)将聚乙二醇单甲醚与小分子链转移剂PETTC溶解到有机溶剂中，加入二环己基碳二亚胺以及4-二甲氨基吡啶催化反应，洗涤、干燥，用无水乙醚沉淀，得到式a所示结构的聚乙二醇单甲醚化合物；

其中_X为10-500

(2)将7-乙基-10-羟基喜树碱和琥珀酸单[2-[(2-甲基-丙烯酰基)氧]乙基]酯加入到有机溶剂中，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺作用下，室温反应24h以上，经洗涤、干燥、浓缩、过柱，得到式b所示结构的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物(简称MMESSN-38)；

(3)将胆固醇氯甲酸酯和甲基丙烯酸羟乙酯溶解于有机溶剂中，在无水吡啶作的催化作用下，反应过夜，经洗涤、干燥、浓缩、过柱，得到式c所示结构的胆固醇衍生物(简称MACHL)；

(4)将式a所示结构的聚乙二醇单甲醚化合物，式b所示结构的聚(7-乙基-10-羟基喜树碱)化合物以及式c所示结构的聚胆固醇化合物溶解在有机溶剂中，在偶氮二异丁腈的催化作用下，无水无氧条件下加热反应24h以上，透析除去小分子，得到式Ⅰ所示7-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体。

所述的有机溶剂包括二氯甲烷、苯甲醚、三氯甲烷、四氢呋喃、吡啶、二甲基亚砜、N,N’-二甲基甲酰胺等反应溶剂中的一种。

本发明还提供了7-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体组装包载钙泊三醇的纳米颗粒的制备方法，包括透析法、薄膜法和溶剂蒸发法。

优选的，以透析法为例，所述的7-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体包载钙泊三醇的纳米颗粒的制备方法包括：称取7-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体粉末，溶解于有机溶剂中，加入钙泊三醇，充分混合，向溶液缓慢滴加去离子水，充分搅拌，滴加完成后，利用半透膜透析除去有机溶剂，离心去除游离小分子化合物后，通过常温减压蒸馏，得到7-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体包载钙泊三醇的纳米颗粒溶液。

所涉及纳米颗粒制作方法中用到的有机溶剂包括四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N’-二甲基甲酰胺等与水混合的溶剂中的一种。

所述的7-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体包载钙泊三醇的纳米颗粒的尺寸范围为10nm-300nm，纳米颗粒的尺寸以及包载钙泊三醇的量可以通过控制聚(7-乙基-10-羟基喜树碱)以及聚胆固醇的分子量来达到。控制纳米颗粒的尺寸和所载钙泊三醇的量可以使得药物体内药代动力学数值受到控制，使得同一制剂治疗不同癌症、病人的个性化治疗成为可能。

本发明具有以下有益效果：

由于7-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体中键合7-乙基-10-羟基喜树碱的化学键可以在肿瘤处高效断裂，故该聚合物药物前体具有很高的肿瘤毒性而对正常组织毒性较低。

由于7-乙基-10-羟基喜树碱具疏水性很强，通过引入聚乙二醇单甲醚，使得该药物前体在水中自组装形成纳米颗粒，极大的提高了7-乙基-10-羟基喜树碱在水中的溶解度，使得其体内应用成为可能。同时该药物前体纳米胶束具有极高的载药量，可以减少药物使用量，以减少药物在健康组织中的副作用。

由于钙泊三醇能高效抑制星状细胞的活性，降低星状细胞对肿瘤的增殖、耐药和转移作用。通过在7-乙基-10-羟基喜树碱聚合物药物前体创新性得引入胆固醇，高效包载钙泊三醇形成纳米颗粒，显著降低了钙泊三醇在正常组织中的分布，并使其毒副作用降低。

附图说明

图1为实施例1制备的聚乙二醇单甲醚化合物的核磁共振氢谱图；

图2为实施例1制备的MMESSN-38的核磁共振氢谱图；

图3为实施例1制备的MACHL的核磁共振氢谱图；

图4为实施例1制备的PEG-PSN-38-PCHL的核磁共振氢谱图；

图5为实施例1制备的PEG-PSN-38-PCHL的凝胶渗透色谱表征图；

图6为实施例1制备的PEG-PSN-38-PCHL的临界胶束浓度CMC测定图；

图7为实施例1制备的PEG-PSN-38-PCHL包载钙泊三醇形成的纳米颗粒的动态光散射图；

图8A为实施例1制备的PEG-PSN-38-PCHL包载钙泊三醇形成的纳米颗粒的透射电镜图，图8B为图8A的放大图；

图9为实施例1制备的PEG-PSN-38-PCHL包载钙泊三醇形成的纳米颗粒中7-乙基-10-羟基喜树碱和钙泊三醇的体外释放速率图。

具体实施方式

以下结合具体附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但应当注意，以下并不限制本发明的范围。

实施例1

合成式I所示7-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体，其中聚乙二醇数均分子量为5000，聚(7-乙基-10-羟基喜树碱)嵌段中7-乙基-10-羟基喜树碱残基数为12，分子量为7200，聚胆固醇嵌段中胆固醇残基数为4，分子量为2100。

一、聚乙二醇单甲醚化合物的合成

取2.5g分子量为5000的聚乙二醇单甲醚(0.5mmol)，溶于50mL甲苯中，回流除水至蒸出的甲苯变得澄清，在氮气保护下加入50mL二氯甲烷，冰浴降温，并在冰浴条件下加入300mg二环己基碳二亚胺(1mmol)，缓慢滴加含有4当量的小分子PETTC以及20mL含12mg 4-二甲氨基吡啶(0.1mmol)的二氯甲烷。室温下反应过夜，1N盐酸水溶液洗涤3次，饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，并放置与-20℃乙醚中重结晶，收集沉淀，冷无水乙醚洗涤三次，常温真空烘箱干燥得到产物(2.1g，产率74％)。得到聚乙二醇单甲醚化合物核磁图谱如图1所示。

检验聚乙二醇单甲醚化合物的核磁图分峰如下：¹H>5K-PETTC>3.(400MHz,CDCl₃,298K):δ(ppm)＝1.90(s,3H,-CH₃),2.37-2.61(m,4H,-CH₂),3.0(t,2H,-CH₂),3.38(s,3H,-CH₃),3.43-3.83(m,456H),7.23-7.34(m,5H).

二、MMESSN-38的合成

称取7-乙基-10-羟基喜树碱2g(5mmol)，2.4g(10mmol)的琥珀酸单[2-[(2-甲基-丙烯酰基)氧]乙基]酯，溶于150mL二氯甲烷中，后加入18mL无水吡啶，冰浴环境下搅拌，将1.9g(10mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)溶于25mL二氯甲烷溶液通过恒压滴液漏斗缓慢滴，滴加完成后室温搅拌过夜。反应至溶液澄清，过滤，收集滤液，浓度为1N的稀盐酸溶液洗涤3次，萃取，旋蒸浓缩，与-20℃的冰乙醚中重结晶，得到MMESSN-38的粗产物，并使用体积比95:5的二氯甲烷/无水甲醇洗脱液，在200目硅胶柱上通过柱层析提纯，得到MMESSN-38 1.4g(产率46％)核磁图谱如图2所示。

检验MMESSN-38的核磁图分峰如下：¹H>3.(400MHz,CDCl₃,298K)δ＝8.32(d,J＝9.2Hz,1H),7.94-7.70(m,2H),7.58(dd,J＝9.2,2.3Hz,1H),6.13(s,1H),5.74(d,J＝16.4Hz,1H),5.62-5.46(m,1H),4.53-4.18(m,4H),3.18(q,J＝7.6Hz,2H),3.00(t,J＝6.6Hz,2H),2.85(t,J＝6.6Hz,2H),2.10-1.69(m,5H),1.41(t,J＝7.6Hz,3H),1.04(t,J＝7.4Hz,3H).

三、MACHL的合成

取9.0g胆固醇氯甲酸酯(20mmol)，溶于100mL干燥二氯甲烷中，加入22mol的无水吡啶(1.75g)。冰浴条件下滴加含有3.9g甲基丙烯酸羟乙酯(30mol)的30mL干燥二氯甲烷，室温下搅拌过夜。使用浓度为1N的稀盐酸溶液洗涤3次，干燥后旋蒸浓缩，使用200目硅胶柱纯化，洗脱剂为二氯甲烷/正己烷＝3:1，收集滤液，旋干后置于真空烘箱干燥过夜，得到胆固醇单体(5.4g，产率47％)核磁图谱如图3所示。

检验MACHL的核磁图分峰如下：¹H>3(400MHz,CDCl₃,298K):δ(ppm)＝0.55-2.04(m,41H,-CH₃,-CH(CH₃)-,-CH-,-CH₂-),2.32-2.51(m,2H,-CH₂),4.32(s,4H,-CO-O-CH₂-CH₂-O-CO-),4.48-4.50(m,1H,-CHO-),5.39-5.40(m,1H,-C(CH₂-)＝CH-),5.55-5.60(m,1H,CH₃-C＝CH₂),6.10-6.20(m,1H,CH₃-C＝CH₂).

四、PEG-PSN38-PCHL的合成

嵌段聚合物PEG-PSN-38的合成采用RAFT自由基聚合，如图所示，取大分子链转移剂PEG-PETTC 213mg(0.04mmol)、SN-38单体MMESSN-38 250mg(0.42mmol)胆固醇单体MACHL100mg(0.17mmol)以及AIBN(3.3mg，0.02mmol)，共同溶解在1mL氢化钙除水的DMSO和1mL干燥的二氧六环中，超声充分溶解。氮气鼓泡30min，冻融法除水除氧3-5次，然后将聚合瓶封闭，置于70℃的油浴锅中聚合反应16h。反应结束后将聚合瓶置于液氮中冷冻，打开瓶塞在乙醇溶液中缓慢升温，将溶液置于截留分子量为3500Da的半透膜透析袋中，用250mL的DMSO溶液在40℃环境下透析3次，每次12小时，接着用250mL的DMF溶液在40℃环境下透析3次，每次12小时。将DMF置换成水，冷冻得到产物(280mg，产率50％)，产物的核磁图谱如图4所示。

检验PEG-PSN38-PCHL的核磁图分峰如下：¹H>3.(400MHz,CDCl₃,298K)δ(ppm)＝7.02-8.52(dd,48H),6.47(s,14H),5.82-5.73(d,48H),3.78-4.58(d,64H),3.39-3.83(m,452H),2.96(d,J＝28.0Hz,12H),2.83-2.63(m,12H),2.63-2.27(m,32H),2.14(s,48H),1.84(s,48H),1.55-0.05(m,50H).

所得到产物的凝胶排阻色谱图如图5所示，产物PEG-PSN38-PCHL的保留时间显著低于大分子引发剂PEG-PETTC。PEG-PSN38-PCHL可在水中自发组装成纳米颗粒，通过尼罗红法测量其形成纳米颗粒所需临界胶束浓度，如图6所示，其临界胶束浓度为46.64μg/mL。

上述合成路线如下所示：

五、7-乙基-10-羟基喜树碱两亲性共聚物药物前体组装包载钙泊三醇的纳米颗粒的制备

称取5mg PEG-PSN-38-PCHL聚合物粉末溶解于1mL DMSO中，另取10mg钙泊三醇溶解在1mL DMSO当中配成钙泊三醇储备液，取75μL钙泊三醇储备液加入1mL聚合物的DMSO溶液中，补齐至1.5mL DMSO，充分混合超声5分钟，向其中缓慢滴加5mL去离子水，充分搅拌十五分钟后，用醋酸纤维半透膜(截留分子量为3500Da)于500mL去离子水中透析三次，每次两小时。透析完成后，3300rpm离心5分钟，上清液通过35℃减压蒸馏将聚合物浓缩到适宜浓度。通过高效液相色谱测定其中钙泊三醇和7-乙基-10-羟基喜树碱的浓度，推算其包封率。

如图7所示，通过动态光散射仪测定包载钙泊三醇后的纳米颗粒粒径，所得纳米颗粒粒径为110纳米，通过透射电子显微镜表征所得纳米颗粒的形貌特征；如图8A所示，可以发现包载钙泊三醇后形成的纳米颗粒为大小较为均一的球状纳米颗粒。对电镜图进一步放大，由图8B可知，该球形纳米颗粒粒径约为100纳米，使用透析法测定纳米颗粒中钙泊三醇和7-乙基-10-羟基喜树碱的释放速度，即将所得纳米颗粒置于截留分子量为3500道尔顿的半透膜透析袋中，再将透析袋混合于缓冲溶液中测定透析袋外的药物浓度；如图9所示，钙泊三醇和7-乙基-10-羟基喜树碱均逐步释放，钙泊三醇释放速度快于7-乙基-10-羟基喜树碱，达到了两种药物控制缓释的作用。