基于通心络预处理的心肌细胞来源外泌体及其制备方法

摘要

本发明提供了一种基于通心络预处理的心肌细胞来源外泌体及其制备方法。本发明提供一种心肌细胞来源外泌体的制备方法，该方法包括：采用通心络预处理心肌细胞，并对预处理过的心肌细胞行缺氧/复氧处理后收集其分泌的外泌体。本发明可制备出具有减少心肌微血管内皮细胞凋亡、从而减轻心肌缺血再灌注损伤功效的心肌细胞来源外泌体。

说明书

技术领域

本发明是关于一种基于药物预处理的心肌细胞来源外泌体及其制备方法，具体是关于一种基于药物通心络预处理的心肌细胞来源外泌体及其制备方法。

背景技术

WHO统计数据表明：2016年心血管疾病是全球第一大死因(约1760万人，32.2％)，其中有948万人死于缺血性心脏病(17.3％)(Collaborators GM.Global,regional,andnational under-5 mortality,adult mortality,age-specific mortality,and lifeexpectancy,1970–2016:a systematic analysis for the Global Burden of DiseaseStudy 2016.The Lancet 2017；390(10100):1084-1150；Collaborators GCOD.Global,regional,and national age-sex specific mortality for 264 causes of death,1980–2016:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study2016.The Lancet 2017；390(10100):1151-1210)。急性心肌梗死(acute myocardialinfarction,AMI)可导致大量心肌缺血坏死，进而致残致死。及时有效的再灌注治疗(如经皮冠状动脉介入治疗)是AMI时挽救心肌的最有效方法(Anderson,J.L.,and Morrow,D.A.(2017).Acute myocardial infarction.N.Engl.J.Med.376,2053–2064.)。然而，再灌注治疗的同时也因为引发“氧化应激”或“钙超载”等反应而引起心肌细胞的损伤，即心肌缺血再灌注损伤(Yellon,D.M.,and Hausenloy,D.J.(2007).Myocardial reperfusioninjury.N.Engl.J.Med.357,1121–1135.)。据报道，再灌注治疗可减少40％的心肌细胞死亡，而剩余的死亡心肌细胞中，却有30％是由再灌注损伤引起的(Yellon,D.M.,andHausenloy,D.J.(2007).Myocardial reperfusion injury.N.Engl.J.Med.357,1121–1135.)。因此，减轻心肌缺血再灌注损伤可改善AMI患者预后，减少国家的疾病负担。然而，目前尚无有效药物可减轻心肌缺血再灌注损伤(Heusch,G.(2015).Molecular basis ofcardioprotection:signal transduction in ischemic pre-,post-,and remoteconditioning.Circ.Res.116,674–699)。

外泌体具有来源广、稳定、无免疫原性等优点，有望减轻心肌缺血再灌注损伤，成为新一代的心肌修复产品(Lamichhane TN,Sokic S,Schardt JS,Raiker RS,Lin JW,JaySM.Emerging Roles for Extracellular Vesicles in Tissue Engineering andRegenerative Medicine.Tissue Engineering Part B:Reviews 2015；21(1):45-54)。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种心肌细胞来源外泌体的制备方法。

本发明的另一目的在于提供所制备的心肌细胞来源外泌体。

本发明的研究发现，通心络(Tongxinluo,TXL)预处理心肌细胞，可制备出具有减少心肌微血管内皮细胞凋亡、从而减轻心肌缺血再灌注损伤功效的心肌细胞来源外泌体。

一方面，本发明提供了一种心肌细胞来源外泌体的制备方法，该方法包括：采用通心络预处理心肌细胞，并对预处理过的心肌细胞行缺氧/复氧处理后收集其分泌的外泌体。

本发明中所用通心络(Tongxinluo,TXL)为一种药物，其应符合相关质量标准要求。

根据本发明的具体实施方案，本发明的心肌细胞来源外泌体的制备方法包括：

药物通心络预处理心肌细胞；更换培养基；缺氧处理及复氧处理心肌细胞。

根据本发明的具体实施方案，本发明的心肌细胞来源外泌体的制备方法中，采用通心络预处理心肌细胞的过程包括：

在心肌细胞的DMEM培养基中(无糖、无血清、无外泌体等)加入通心络1～6小时后，更换细胞培养基为无通心络的DMEM培养基，进行缺氧/复氧处理。

根据本发明的具体实施方案，本发明的心肌细胞来源外泌体的制备方法中，所述缺氧/复氧处理为缺氧18小时/复氧2小时处理，具体的过程包括：

通心络预处理后的心肌细胞于厌氧、37℃、5％CO₂中缺氧处理18小时；缺氧18小时后，复氧2小时。

根据本发明的具体实施方案，本发明的心肌细胞来源外泌体的制备方法中，复氧结束后收集条件培养基，并利用离心法分离得到经通心络处理和缺氧/复氧刺激的心肌细胞分泌的外泌体。

根据本发明的具体实施方案，本发明的心肌细胞来源外泌体的制备方法中，离心法包括：收集条件培养基后，依次离心去除细胞、离心去除细胞碎片、离心去除大囊泡，然后离心收取沉淀并重悬后，再次离心获得外泌体。

具体地，本发明的心肌细胞来源外泌体的制备方法中，离心法包括：收集条件培养基后，300g离心10min去除细胞；2000g离心20min去除细胞碎片；16500g高速离心30min去除大囊泡；120000g超速离心70min收取沉淀并重悬后，再次120000g超速离心70min获得外泌体。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明的心肌细胞来源外泌体的制备方法包括：

心肌细胞弃去培养基，冲洗干净以去除残留的完全培养基，加入溶有通心络的DMEM培养基(无糖、无血清、无外泌体等)，处理细胞1～6小时(期间维持心肌细胞的正常培养状态)；更换培养基为无通心络的DMEM培养基(无糖，无血清、无外泌体等)，置于含厌氧指示条(BioMérieux，96118)的缺氧盒(BioMérieux，96127)中，放入厌氧袋(Mitsubishi GasChemical Company，C-1)，迅速关闭缺氧盒；将缺氧盒置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中，缺氧处理18小时。注：此缺氧装置完全清除缺氧盒中的氧气需2.5小时，而在缺氧袋放入1.5小时后盒内便已达低氧状态(指示条由蓝色变白)。本发明的缺氧处理时间并不计算将细胞置入缺氧盒中的最开始1.5小时。缺氧18小时后，在无菌操作台里将培养瓶(板)盖子打开，摇晃培养基以促使细胞迅速复氧，再盖好盖子放回培养箱复氧2小时。

根据本发明的具体实施方案，本发明的心肌细胞来源外泌体的制备方法中，所述心肌细胞为人心肌细胞(Promocell,C-12810)。

另一方面，本发明还提供了按照本发明所述方法制备得到的外泌体。与现有技术得到的外泌体相比，本发明制备的外泌体linc-ROR含量更高，其中linc-ROR可减轻缺氧/复氧(缺血再灌注)引起的损伤。

另一方面，本发明还提供了通心络在制备促进心肌细胞在缺氧/复氧后分泌具有减少心脏微血管内皮细胞凋亡并减轻心肌缺血再灌注损伤的外泌体的制剂中的应用。

根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，利用400μg/ml通心络预处理心肌细胞1～6小时。

另一方面，本发明还提供了一种促进心肌细胞分泌外泌体的方法，该方法包括：

采用通心络预处理心肌细胞，并对预处理过的心肌细胞行缺氧/复氧处理，促进心肌细胞分泌外泌体。

根据本发明的具体实施方案，本发明的促进心肌细胞分泌外泌体的方法中，是利用本发明前述的方法处理心肌细胞，促进心肌细胞分泌具有减少心脏微血管内皮细胞凋亡并减轻心肌缺血再灌注损伤的外泌体。

根据本发明的具体实施方案，其中，促进心肌细胞分泌外泌体包括上调外泌体中linc-ROR的表达水平。即，本发明还提供了上调心肌细胞来源外泌体中linc-ROR的表达水平的方法，该方法包括利用本发明前述的方法处理心肌细胞，促进心肌细胞分泌linc-ROR含量更高的外泌体。

在本发明的一个具体实施方案中，利用400μg/ml TXL预处理后用缺氧(18小时)/复氧(2小时)刺激心肌细胞可获得linc-ROR含量更高的外泌体，可减少缺氧/复氧(缺血/再灌注)引起的微血管内皮细胞凋亡和减轻心肌缺血再灌注损伤。

附图说明

图1显示不同浓度TXL对心肌细胞活性的影响。

图2A-图2B显示缺氧/复氧刺激TXL预处理心肌细胞及无TXL预处理心肌细胞后所获条件培养基对缺氧/复氧引起的微血管内皮细胞凋亡的作用差异。

图3A-图3B显示本发明心肌细胞来源外泌体的鉴定结果。

图4A-图4B显示TXL预处理及缺氧/复氧刺激的心肌细胞来源外泌体减少缺氧/复氧引起微血管内皮细胞凋亡的检测结果。

图5A-图5B显示TXL预给药1小时可显著减少缺血再灌注后的心梗面积，而该作用由外泌体介导。

图6A-图6B显示经TXL预处理心肌细胞缺氧/复氧时对微血管内皮细胞的保护作用与上调其外泌体中linc-ROR有关的检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的特点及所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实施例中所用TXL购自石家庄以岭药业股份有限公司，其主要成分如下：

通心络主要成分药材部位比例(％)人参根和地下茎1.7赤芍根1.6酸枣仁种1.2檀香提取物树干心材0.4降香树干心材和根4.0乳香树脂6.0冰片C₁₀H₁₈O3.6水蛭干体23.6全蝎干体18.1土蟞虫雌性干体18.1蜈蚣干体3.6蝉蜕皮18.1

实施例1

心肌细胞来源外泌体的制备方法：

培养人心肌细胞(CM)并传代扩增至第5～7代备用。将TXL溶于无糖无血清DMEM培养基(Life Technologies,美国)中，预处理CM 1小时后，更换细胞培养基为无TXL无糖无血清DMEM培养基。将CM置于含厌氧指示条的缺氧盒中，放入厌氧袋，迅速关闭缺氧盒；将缺氧盒置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中，缺氧处理18小时。缺氧18小时后，在无菌操作台里将培养瓶(板)盖子打开，摇晃培养基以促使细胞迅速复氧，再盖好盖子放回培养箱复氧2小时【注：此缺氧装置完全清除缺氧盒中的氧气需2.5小时，而在缺氧袋放入1.5小时后盒内便已达低氧状态(指示条由蓝色变白)。本发明的缺氧处理时间计算方式并不计算将细胞置入缺氧盒中的最开始1.5小时】。

收取复氧后条件培养基并利用超速离心法分离得到TXL预处理及缺氧/复氧刺激的CM分泌的外泌体(CM^TXL-exo)。超速离心法具体步骤包括：300g离心10min去除细胞；2000g离心20min去除细胞碎片；16500g高速离心30min去除大囊泡；120000g超速离心70min收取沉淀并重悬后，再次120000g超速离心70min获得外泌体。

明确不同浓度TXL对CM的活性影响；明确TXL预处理过CM在缺氧/复氧刺激后所获条件培养基对缺氧复氧时微血管内皮细胞的保护作用，提示条件培养基有保护微血管内皮细胞的物质；提取上述条件培养基中的外泌体(CM^TXL-exo)，对其进行鉴定；证明CM^TXL-exo可减少缺氧/复氧引起的微血管内皮细胞凋亡；体内(动物)实验证明TXL预给药对心肌缺血再灌注损伤的保护作用由外泌体介导；最后证明CM^TXL-exo对微血管内皮细胞的保护由长链非编码RNA>

评价指标(研究结果)

使用CCK-8试剂盒(Dojindo，日本)评估不同浓度TXL(100、200、400、800及1200μg/ml)对CM活性的影响，发现大于或等于800μg/ml TXL对CM有毒性作用，故采用400μg/ml TXL进行下一步实验。具体结果见图1。图1中：与0g/mL TXL相比，P<0.05；与800g/mL TXL相比，P<0.05。

对TXL预处理CM及无TXL预处理CM进行缺氧/复氧，收取相应条件培养基，并比较这两种条件培养基对缺氧复氧引起的微血管内皮细胞凋亡的作用差别，结果参见图2A-图2B，其中，*与Control组相比，P<0.05；Normal：内皮细胞正常培养组，即未进行缺氧复氧处理；Control：内皮细胞缺氧复氧对照组；CM medium：该组内皮细胞缺氧复氧时与普通心肌细胞缺氧复氧刺激后所得条件培养基共培养；CM ^TXL>

利用超速离心法分离条件培养基中的CM^TXL-exo，其在电镜(HITACHI,H-600IV,日本)下呈现球形或圆盘形，大小在100nm左右；Western>TXL-exo表达CD63和CD81等外泌体蛋白标志物。具体结果可参见图3A-图3B，其中，图3A：电镜下观察CM^TXL-exo的形态结构，呈球形或圆盘形，大小在100nm左右；图3B：外泌体的蛋白标志物鉴定，CM^TXL-exo高表达CD63和CD81等外泌体蛋白标志物。

与对照组相比，CM^TXL-exo可显著减少缺氧/复氧时微血管内皮细胞的凋亡，具体可见图4A-图4B。图中，*与Control相比，P<0.05；Normal：内皮细胞正常培养组，即未进行缺氧复氧处理；Control：内皮细胞缺氧复氧对照组；CM^TXL-Exosome:内皮细胞缺氧复氧时，与通心络预处理过心肌细胞经缺氧复氧刺激后所分泌外泌体共培养。

TXL预给药1小时可显著减少缺血/再灌注后的心梗面积(从～59％减少到～40％)，减少心肌缺血再灌注损伤，而该作用可被外泌体分泌抑制剂GW4869部分消除，提示TXL预给药对心肌缺血再灌注损伤作用由外泌体介导，见图5A-图5B。图中，*与TXL组相比，P<0.05；sham:冠状动脉未结扎组；Control：冠状动脉结扎对照组；TXL：冠状动脉结扎+通心络；TXL+GW4869：冠状动脉结扎+通心络+外泌体释放抑制剂GW4869组。

与CM-exo相比，CM^TXL-exo中linc-ROR显著增加，高达4倍。利用小干扰RNA敲低TXL预处理CM中的linc-ROR的表达水平，缺氧/复氧时将该细胞与微血管内皮细胞共培养，发现CM^TXL不再有保护作用，见图6A-图6B。图中，*与CM^TXL相比，P<0.05；与CM^siRNA+TXL相比，P<0.05；Normal：内皮细胞正常培养组，即未进行缺氧复氧处理；Control：内皮细胞缺氧复氧对照组；CM^TXL：该组内皮细胞缺氧复氧时与通心络预处理过心肌细胞共培养；CM^siRNA+TXL：该组内皮细胞缺氧复氧时，与通心络预处理过和linc-ROR>NC^+TXL：该组内皮细胞缺氧复氧时，与通心络预处理过和阴性对照siRNA转染过的心肌细胞共培养。

结论：利用400μg/ml TXL预处理CM 1小时后并对其进行缺氧18小时/复氧2小时可获得具有保护微血管内皮细胞进而减少心肌缺血再灌注损伤的外泌体，其机制与上调外泌体中的linc-ROR水平有关。

此外，发明人利用400μg/ml TXL预处理CM 6小时后并对其进行缺氧18小时/复氧2小时进行上述实验，可获得基本相同的实验结果。