用于转基因水稻筛查的通用阳性标准质粒及其构建方法

摘要

本发明公开了用于转基因水稻筛查的通用阳性标准质粒及其构建方法；所述通用阳性标准质粒包括载体骨架和筛选元件，所述的筛选元件包括CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子、NOS终止子、CaMV35S终止子、Bar基因、HPT基因、Bt基因、SPS基因和PLD基因。本发明进一步公开了构建所述通用阳性标准质粒的方法及其在转基因水稻筛查、检测和监测中的应用。在转基因水稻筛查检测时，采用本发明提供的通用阳性标准质粒作为阳性对照品和质控样品可检测多种转基因水稻，具有适用性宽、覆盖面广泛等特点。

说明书

技术领域

本发明涉及通用阳性标准质粒，尤其涉及用于转基因水稻筛查的通用阳性标准质粒，本发明进一步涉及该通用阳性标准质粒构建方法及其在转基因水稻筛查、检测和监测中的应用，属于转基因水稻筛查的通用阳性标准质粒的构建和应用领域。

背景技术

随着全球转基因生物研发及商业化的迅猛发展，越来越多的转基因作物在不同的国家和地区被批准商业化种植。就水稻而言，目前已有许多抗虫、抗病、耐除草剂及营养成分改良的转基因水稻研发成功。但转基因作物在带来巨大的社会经济效益的同时，也存在潜在的环境和食品安全问题，一直以来饱受争议。

水稻作为重要的粮食作物，目前仅转基因抗虫水稻品种华恢1号及其杂交种Bt汕优63在2009年获得中国农业部颁发的生产应用安全证书，且并未获批进行商业化种植。但从2005年起，国际和中国国内都陆续发现水稻被LLRICE601、Bt汕优63、科丰6号和克螟稻等转基因成分污染的现象。且随着生物技术产业的快速发展，获批的和处于田间试验阶段的转基因作物越来越多，转基因作物意外或故意泄漏的风险也随之加大，对环境和食品安全造成威胁，也极易引起民众恐慌和贸易纠纷。因此，加强对转基因水稻的筛查、检测和监管尤为重要。

在日常检测过程中，阳性标准物质是检测过程中的标尺，但以植物原材料制备标准物质的操作过程复杂，且对环境和仪器设备的要求也比较高。且在转基因筛查检测过程中，很多检测机构是根据检测的靶标选用含有相应靶标的转化事件特异性检测用标准物质作为阳性对照，这样筛查检测中针对多个检测靶标需要多个阳性对照，提高了检测成本，也给检测工作增添不便。

2002年，日本科学家Kuribara H提出的阳性质粒标准物质可以不依赖原材料，采用基因合成技术就可以将多个外源目的基因共同构建入一个质粒分子中，并通过微生物进行存储和大量培养。质粒DNA提取容易且纯度较高，可以有效解决阳性标准品匮乏和制备困难的问题，给检测工作带来便利。因此开发一种针对转基因水稻筛查检测用阳性质粒分子具有重要的意义。

目前已有部分专利和文献报道了转基因水稻筛查的重组标准质粒，例如汪小福等于2013年利用重叠PCR技术将CaMV35S启动子、SPS基因、Bt基因、NPTⅡ基因、Htp基因、Bar基因和NOS终止子片段克隆构建到载体pUC-19中，获得转基因水稻筛查的重组标准质粒pUC-RS(发明名称：一种用于转基因水稻筛查的重组标准质粒及试剂盒；专利申请公开号：CN103215346A)。以及李晓飞等于2013年将CaMV35S启动子、NOS终止子，标记基因Bar、HPT和NPTⅡ基因作为转基因水稻的筛查检测靶标构建了质粒分子pBS Rice用于转基因水稻的检测(李晓飞等.转基因水稻检测用阳性质粒分子的构建及应用，2013)。

但是，现有的用于筛查检测转基因水稻的阳性质粒分子不同程度的存在元件的靶标序列适用性较窄、覆盖面不够广泛等缺陷，有待改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种可筛查检测转基因水稻的阳性质粒分子，在转基因水稻筛查检测时，用其作为阳性对照品和质控样品可检测多种转基因水稻，具有适用性宽、覆盖面更为广泛等优点。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种用于转基因水稻筛查的通用阳性标准质粒，包括载体骨架和筛选元件；其中，所述的筛选元件包括CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子、NOS终止子、CaMV35S终止子、Bar基因、HPT基因、Bt基因、SPS基因和PLD基因。

作为一种优选的实施方式，所述的SPS基因选自SEQ ID No.8或SEQ ID No.9所示的核苷酸序列中的任何一种或同时选自SEQ ID No.8或SEQ ID No.9这两种序列。

作为一种优选的实施方式，所述CaMV35S启动子的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；所述Ubiquitin启动子的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；所述NOS终止子的核苷酸序列SEQ ID No.3所示；所述CaMV35S终止子的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示；所述Bar基因的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示；所述HPT基因的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示；所述Bt基因的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示；所述PLD基因的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示。

所述的筛选元件由CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子、NOS终止子序列、CaMV35S终止子、Bar基因、HPT基因、Bt基因、SPS基因和PLD基因序列按照任意的顺序进行连接而得到；作为本发明的一种具体的实施方案，由CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子、NOS终止子序列、CaMV35S终止子、Bar基因、HPT基因、Bt基因、SPS基因和PLD基因序列依次进行连接组成所连接得到的融合基因的核苷酸序列为SEQ ID No.11所示。

本发明进一步提供了一种通用阳性标准质粒的构建方法，包括：将CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子、NOS终止子、CaMV35S终止子、Bar基因、HPT基因、Bt基因、SPS基因和PLD基因拼接在一起后得到融合基因；将该融合基因连接到载体骨架上得到重组质粒；将重组质粒转化大肠杆菌受体菌，即得。

作为一种优选的实施方式，将CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子、NOS终止子、CaMV35S终止子、Bar基因、HPT基因、Bt基因、SPS基因和PLD基因依次拼接在一起后得到的融合基因的核苷酸序列为SEQ ID No.11所示。

作为一种优选的实施方式，所述的载体骨架是pUC18质粒。

本发明所提供的通用阳性标准质粒能够应用于转基因水稻筛查、检测和监测；包括：将所述的通用阳性标准质粒作为转基因水稻检测用的阳性对照质粒或阳性标准品，对待检测的水稻样品进行转基因成分的普通PCR和实时荧光PCR筛查检测。

本发明详细技术方案整体描述

本发明通过查阅国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)网站的“GM ApprovalDatabase”数据库，查询到8个转基因水稻转化体。其中，含有2个国内研发的水稻转化体：转Bt基因水稻华恢1号/TT51-1及其杂交种Bt汕优63。结合检索和收集到的国内11个水稻转化体的转化元件、标记基因等信息。选择7个水稻筛查元件/基因：CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子、NOS终止子、CaMV35S终止子、Bar基因、HPT基因、Bt基因；以及2个水稻内标准基因：SPS(2个片段)和PLD，用于构建转基因水稻筛查元件阳性质粒分子。对这7个外源元件/基因进行检测，可实现本发明中19个已知转基因水稻品种的全覆盖。

通过转基因检测方法数据库(GMDD，http://gmdd.sjtu.edu.cn/)和欧盟转基因食品和饲料参考方法数据库(http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/)检索相关转基因检测方法，并结合已发布的农业部标准、现有专利或文献上的相关检测方法和序列信息，最终确定转基因水稻筛查元件/基因和内标准基因的靶标序列。

上述转基因水稻筛查元件/基因和内标准基因的序列号和所含核苷酸片段如表1所示：

表1水稻筛查元件/基因和内标准基因的序列号

由此，本发明提供了一种用于转基因水稻筛查的阳性通用标准质粒，是一种聚合转基因水稻筛查元件/基因和2个常用水稻内标准基因的阳性质粒分子，含有SEQ ID No.1～SEQ ID No.7和SEQ ID No.10中核苷酸片段，且含有SEQ ID No.8～SEQ ID No.9中任意一个或两个核苷酸片段。

优选的，所述转基因水稻筛查元件质粒分子是含有SEQ ID No.1～SEQ ID No.10共十个核苷酸片段；所述十个核苷酸片段可以按照任意的顺序进行连接。

在本发明的实施例中，将7个水稻筛查元件/基因(pCaMV35S、pUbiquitin、tNOS、tCaMV35S、Bar、HPT、Bt)和2个常用水稻内标准基因(SPS和PLD)的检测靶标序列SEQ IDNo.1～SEQ ID No.10按SEQ ID No.1～SEQ ID No.10的顺序拼接到一起拼接成一段长3791bp的序列SEQ ID No.11；将拼接的融合序列SEQ ID No.11人工合成并装载到pUC18质粒上，从而得到转基因水稻筛查元件阳性质粒分子，记为pUC18-RICE-sceen。

本发明经过PCR扩增验证，证明上述构建的转基因水稻筛查元件阳性质粒分子具有筛查覆盖面积广、易大量获得，且制备简单等特点，可作为转基因水稻筛查检测时的阳性对照样品，用于大部分已公告的水稻转化体和在研转基因水稻的筛查、检测与监管工作。且每个筛查元件/基因靶标序列的选择力求其具有最广的适用性，经实验证明，上述pUC18-RICE-sceen质粒作为阳性对照，适用于表13和表14中所列7个筛查元件/基因和2个水稻内标准基因现有农业部和出入境标准，有效解决了转基因水稻筛查检测中缺乏阳性对照或标准品的技术问题，避免了筛查检测中针对多个检测靶标制备多个阳性对照的问题，显著降低了人力成本和经济成本。

附图说明

图1 19个转基因水稻外源元件信息矩阵。

图2 选用的7个筛查元件对19个水稻转化体的覆盖示意图。

图3 pCaMV 35S的靶标序列的确定。

图4 pUbiquitin的靶标序列确定。

图5 tNOS的靶标序列确定。

图6 tCaMV 35S的靶标序列确定。

图7 Bar基因的靶标序列确定。

图8 HPT基因的靶标序列确定。

图9 Bt基因的靶标序列确定。

图10 内标准基因SPS(1)的靶标序列确定。

图11 内标准基因SPS(2)的靶标序列确定。

图12 内标准基因PLD的靶标序列确定。

图13 是本发明构建的pUC18-RICE-sceen阳性质粒分子结构图。

图14 是实施例1所得到的pUC18-RICE-sceen阳性质粒分子各元件/基因现有普通PCR定性检测标准适用性验证的电泳图。

图15 是实施例1所得到的pUC18-RICE-sceen阳性质粒用于各元件/基因普通PCR定性检测的适宜浓度测试实验的电泳图。

图16 是实施例1所得到的pUC18-RICE-sceen阳性质粒用于各元件/基因实时荧光PCR检测的适宜浓度测试实验的扩增曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1用于转基因水稻筛查的通用阳性标准质粒的构建

1、确定转基因水稻的检测靶标

通过检索国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)网站的“GM ApprovalDatabase”数据库、相关专利、文献，以及分离、鉴定、测序获取水稻转化体外源基因插入的外源表达框。最终获得国内外19个水稻转化体的转化元件和标记基因等信息。表2为本发明中涉及到的转基因水稻品系的相关信息及其来源。

表2本发明中涉及的转基因水稻品系的相关信息及其来源

通过对上述水稻转化体插入的外源表达框内含有的元件/基因进行统计，绘制矩阵图(图1)，比较分析各水稻转化体中各基因元件的使用频率，选择CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子、NOS终止子、CaMV35S终止子、Bar基因、HPT基因和Bt基因作为转基因水稻筛查检测的靶标。并与2个水稻内标准基因：SPS和PLD共同构建转基因水稻筛查元件阳性质粒。

从选用的7个筛查元件对19个水稻转化体的覆盖示意图(图2)中可以看到，就本发明中涉及到的19个水稻转化体而言，对上述7个筛查元件进行检测，上述检测覆盖率可达到100％。其中，转化体114-7-2和PA110-15覆盖1次，其余转化体均覆盖2次以上。

2、确定靶标序列

通过检索农业部标准、出入境标准、欧盟转基因食品和饲料参考方法数据库(http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/)和转基因检测方法数据库(GMDD，http://gmdd.sjtu.edu.cn/)，收集整理筛查元件/基因和内标准基因相关检测方法的检测引物序列(表3-表12)，并将引物序列与各元件/基因核苷酸序列进行比对(图3-图12)。每个筛查元件/基因靶标序列的选择遵循力求其具有最广的适用性的原则，最终确定转基因水稻筛查元件/基因和内标准基因的靶标序列。

(1)pCaMV 35S的靶标序列确定见图3。

表3 CaMV 35S启动子检测标准对应引物/探针序列

(2)pUbiquitin的靶标序列确定见图4。

表4 Ubiquitin启动子检测标准对应引物/探针序列

(3)tNOS的靶标序列确定见图5。

表5 NOS终止子检测标准对应引物/探针序列

(4)tCaMV 35S的靶标序列确定见图6。

表6 CaMV 35S启动子检测标准对应引物/探针序列

(5)Bar基因的靶标序列确定见图7。

表7 Bar基因检测标准对应引物/探针序列

(6)HPT基因的靶标序列确定见图8。

表8 HPT基因检测标准对应引物/探针序列

(7)Bt基因的靶标序列确定见图9。

表9 Bt基因检测标准对应引物/探针序列

(8)内标准基因SPS(1)(SEQ ID No.8)的靶标序列确定见图10。

表10 SPS基因检测标准对应引物/探针序列

(9)内标准基因SPS(2)(SEQ ID No.9)的靶标序列确定见图11。

表11 SPS基因检测标准对应引物/探针序列

(10)内标准基因PLD的靶标序列确定见图12。

表12 PLD基因检测标准对应引物/探针序列

3、通用阳性标准质粒的构建和保藏

按照表1中对应所述的核苷酸序列，将靶标序列SEQ ID No.1～SEQ ID No.10按顺序拼接成一段长3791bp的序列SEQ ID No.11。将拼接的融合序列SEQ ID No.11人工合成并装载到pUC18质粒上，从而得到转基因水稻筛查元件阳性质粒，命名为pUC18-RICE-sceen。连接顺序及质粒分子大小见图13。

构建得到的阳性质粒pUC18-RICE-sceen转化入大肠杆菌受体菌中，菌种保藏在-80℃冰箱，以载体氨苄青霉素抗性(Amp⁺)为筛选标记。

3、阳性质粒的提取、纯化和测序验证

将保藏的菌种划平板，37℃过夜培养，第二天挑取单克隆菌落在含有氨苄青霉素抗性(Amp⁺)的LB培养液中，37℃，200rpm培养12h，然后用Axygen公司质粒小量DNA提取试剂盒(AxyPrep^TM>

将提取和纯化的质粒分子完成测序验证。测序分析结果显示，pUC18-RICE-sceen质粒是由2653bp的pUC18载体骨架和3791bp的筛选元件集成序列(靶标序列)构成，序列总长6444bp，且阳性质粒中的外源序列与预期序列一致。

试验例1阳性质粒分子各元件/基因现有普通PCR定性检测标准适用性验证试验

1、阳性质粒pUC18-RICE-sceen的提取与检测

将含有阳性质粒分子pUC18-RICE-sceen的大肠杆菌于37℃，200rpm培养12h，按照Axygen公司质粒小量DNA提取试剂盒(AxyPrep^TM>260/OD₂₈₀的比值在1.8左右，符合定性、定量PCR检测要求。

2、阳性质粒验证利用下述对应公告、标准中的普通PCR引物(表13)、反应体系和程序(表14)对转基因水稻筛查元件阳性质粒pUC18-RICE-sceen的进行PCR验证，检验构建质粒是否含有预期的外源片段，以及是否适用于现有农业部和出入境普通PCR定性检测标准，PCR扩增采用ABI公司生产的PCR仪，结果如图14所示。由图14可知，筛查元件/基因均可被有效扩增，说明构建的质粒含有预期目的基因，且适用于现有农业部和出入境检测标准。

表13筛查元件/基因和内标准基因普通PCR检测引物

试验例2转基因水稻筛查元件阳性质粒pUC18-RICE-sceen用于普通PCR定性检测的适宜浓度测试试验

根据阳性质粒DNA初始浓度和大小，用ddH₂O将其依次稀释成1×10⁸copies/μL(梯度1)、1×10⁷copies/μL(梯度2)、1×10⁶copies/μL(梯度3)、1×10⁵copies/μL(梯度4)、1×10⁴copies/μL(梯度5)、1×10³copies/μL(梯度6)、1×10²copies/μL(梯度7)、1×10copies/μL(梯度8)、1copies/μL(梯度9)，4℃保存备用。

以不同浓度的阳性质粒pUC18-RICE-sceen的DNA样品(1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10、1copies/μL)为模板，利用各元件/基因对应公告、标准中的引物(表13)、反应体系和程序(表14)进行普通PCR扩增，判断转基因水稻筛查元件阳性质粒用于普通PCR定性检测的适宜浓度。

实验结果显示，各筛查元件/基因在质粒浓度为1×10²copies/μL(梯度7)及以上的pUC18-RICE-sceen质粒样品中均能被扩增(图15)可满足相应元件/基因定性PCR检测的需求。质粒分子pUC18-RICE-sceen作为阳性对照用于普通PCR筛查检测，稳定扩增的适宜浓度范围为1×10³～1×10⁵copies/μL。

试验例3转基因水稻筛查元件阳性质粒pUC18-RICE-sceen用于实时荧光PCR检测的适宜浓度测试试验

选择试验例2中9个浓度梯度中的5个梯度：1×10⁶copies/μL(梯度3)、1×10⁵copies/μL(梯度4)、1×10⁴copies/μL(梯度5)、1×10³copies/μL(梯度6)、1×10²copies/μL(梯度7)、1×10copies/μL(梯度8)的转基因水稻筛查元件阳性质粒作为DNA模板，利用下述对应公告、标准中的荧光引物(表15)、反应体系(表16)和反应程序，使用Applied>

检测结果显示，各元件/基因对应实时荧光PCR检测引物在不同浓度(1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10copies/μL)的pUC18-RICE-sceen质粒样品中均能检测到荧光信号(图16)，该质粒适用于对应农业部和出入境实时荧光PCR检测标准，可满足相应的检测需求。且质粒分子pUC18-RICE-sceen作为阳性对照用于各筛查元件/基因实时荧光PCR检测的适宜浓度范围为1×10³～1×10⁵copies/μL。

表15各筛查元件/基因和内标准基因实时荧光PCR检测引物

表16各筛查元件/基因实时荧光PCR检测反应体系

试剂体积TaqMan反应缓冲液10.0μL10μmol/L上游引物(F)1.0μL10μmol/L上游引物(R)1.0μL10μmol/L探针(P)0.5μLDNA模板2.0μLddH₂O5.5μL总体积20.0μL

反应程序为：50℃、2min；95℃、2min；95℃、1s；60℃、20s；循环数40；在第二阶段的退火延伸(60℃)时收集荧光信号。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽省农业科学院水稻研究所

<120> 用于转基因水稻筛查的通用阳性标准质粒及其构建方法

<130> AH-2001-190410A

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 287

<212> DNA

<213> Artifical sequence

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tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa 120

agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgacatct ccactgacgt 180

aagggatgac gcacaatccc actatccttc gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc 240

atttcatttg gagaggacag cccaagcttc gactctagag gatcccc 287

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<212> DNA

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caggattcct caaagagaaa cactggcaag ttagcaatca gaacatgtct gatgtacagg 60

tcgcatccgt gtacgaacgc tagcagcacg gatctaacac aaacacggat ctaacacaaa 120

catgaacaga agtagaacta ccgggcccta accatggacc ggaacgccga tctagagaag 180

gtagagagag gggggggggg aggatgagcg gcgtaccttg aagcggaggt gccgacgggt 240

ggatttgggg gagatctggt tgtgtgtgtg tgcgctccga acgaacacga ggttggggaa 300

agagggtgtg gagggggtgt ctatttatta cggcgggcga ggaagggaaa gcgaaggagc 360

ggtgggaaag gaatcccccg taggctgccg tgccgtgaga ggaggaggag gccgcctgcc 420

gtgccgcctc acgtctgccg ctccgccacg caatttctgg atgccgacag cggagcaagt 480

ccaacggtgg agcggaactc tcgagagggg tccagaggca gcgacagaga tgccgtgccg 540

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tcgacggcgt ttaacaggct ggcattatct actcgaaaca agaaaaatgt ttc 653

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<212> DNA

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catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata 180

cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc 240

tatgttacta gatcggg 257

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tgtatttgta tttgtaaaat acttctatca ataaaatttc taattcctaa aaccaaaatc 180

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tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggcccctg gaaggcacgc aacgcctacg 180

actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg ggactgggct 240

ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag agcgtggtcg 300

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caaccggtcg cggaggctat ggatgcgatc gctgcggccg atcttagcca gacgagcggg 180

ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt caatacacta catggcgtga tttcatatgc 240

gcgattgctg atccccatgt gtatcactgg caaactgtga tggacgacac cgtcagtgcg 300

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ttagcgtgtt tgggcaaagg tggggattcg atgctgcaac catcaatagc cgttacaacg 300

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<210> 9

<211> 310

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tacagagtgg atctgtttac tcgtcaagtg tcatctcctg aagtggactg gagctatggg 60

gagcctactg aaatgttaac tccggttcca ctgacggaga gggaagcggt gagagtgctg 120

gtgcgtacat tgtgcgcatt ccgtgcggtc caagggacaa gtacctccgt aaagagccct 180

gtggccttac ctccaagagt ttgtcgacgg agctctcgcg catatctgaa catgtccaag 240

gctctggggg aacaggttag caatgggaag ctggtcttgc catatgtaat ccatggccac 300

tatgccgatg 310

<210> 10

<211> 310

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 10

atcaggcctt gtcagtggca agaacaacac cattgacagg agcatccaag atgcatacat 60

ccacgcaatt cgccgcgcca agaacttcat ctacatcgag aatcagtact tccttggcag 120

ctcatttgca tggaaagccg atggcatcag accagaagac attgaggcgt tgcatctgat 180

tcccagagag atttctctga agattgtgaa caagattgaa gctggtgagc gttttgcagt 240

ctatgttgtg ctgccaatgt ggcctgaagg acctcctgct agtggatcag tgcaggcaat 300

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aaaggaaggt ggctcctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcta tcattcaaga 60

tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa 120

agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgacatct ccactgacgt 180

aagggatgac gcacaatccc actatccttc gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc 240

atttcatttg gagaggacag cccaagcttc gactctagag gatcccccag gattcctcaa 300

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cgaacgctag cagcacggat ctaacacaaa cacggatcta acacaaacat gaacagaagt 420

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ggggtgtcta tttattacgg cgggcgagga agggaaagcg aaggagcggt gggaaaggaa 660

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acaggctggc attatctact cgaaacaaga aaaatgtttc cgatcgttca aacatttggc 960

aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc 1020

tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat 1080

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ctgtcgatcg acaagctcga gtttctccat aataatgtgt gagtagttcc cagataaggg 1260

aattagggtt cctatagggt ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc cttagtatgt 1320

atttgtattt gtaaaatact tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac caaaatccag 1380

tactaaaatc cagatccccc gaattatcgt caaccactac atcgagacaa gcacggtcaa 1440

cttccgtacc gagccgcagg aaccgcagga gtggacggac gacctcgtcc gtctgcggga 1500

gcgctatccc tggctcgtcg ccgaggtgga cggcgaggtc gccggcatcg cctacgcggg 1560

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catgcacgag gcgctcggat atgccccccg cggcatgctg cgggcggccg gcttcaagca 1800

cgggaactgg catgacgtgg gtttctggca gctggacttc agcctgccga ttccggaagt 1860

gcttgacatt ggggagttta gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg 1920

tgtcacgttg caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctacaac cggtcgcgga 1980

ggctatggat gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg 2040

accgcaagga atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc 2100

ccatgtgtat cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc 2160

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gagacgttag cgtgtttggg caaaggtggg gattcgatgc tgcaaccatc aatagccgtt 2640

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