一种微藻快速筛选装置及微藻快速筛选方法

摘要

本发明提供了一种微藻快速筛选装置及微藻快速筛选方法，解决传统筛选不能实现藻株与外界气质交换且效率低的问题，该装置包括培养缸、浮力装置、孔板和藻液培养管；培养缸设有玻璃盖，玻璃盖上方设置进气口和出气口，浮力装置设置于孔板下方，孔板上设置至少1个微藻培养孔，微藻培养孔用于放置藻液培养管，藻液培养管底部设有微孔；微藻快速筛选方法包括：将培养缸中添加培养液；采用橡皮套圈将藻液培养管固定在藻液培养孔内；将藻菌落接入藻液培养管中进行培养，将目的藻株通过酶标仪检测筛选出来。本发明能够实现藻株与外界的气质交换，并可以确保生长环境的稳定性，提高培养效率。

说明书

技术领域

本发明属于藻种培养领域，尤其涉及一种微藻快速筛选装置及微藻快速筛选方法。

背景技术

近年来，随着科技的进步，许多工厂已经慢慢完成了从高污染向清洁生产的转变，节能减排的观念也日益深入人心，但在多年来的社会经济发展过程中，传统的生产生活方式还是使环境污染成为目前人类面临的重要问题。且由于我国目前的科技发展水平不足以改变能源利用结构，煤炭等化石能源依然是我国能源结构的主体，寻求更有效的环境治理方法是许多科研工作者致力解决的问题。而由于微藻能快速吸收空气中的二氧化碳等气体，且能同化水体中的无机盐并能有效吸附水中的重金属离子，这使其能同时实现对空气和污水的净化，且因其细胞结构简单、便于研究的特点，成为许多环境治理研究的对象。

除此之外，微藻对外界环境有很强的适应能力，当一个种群的微藻受到外界环境的胁迫时，在一定的胁迫程度下，部分微藻可以通过自身突变等形式适应新的环境，使种群向有利的方向进化。因此，改变微藻生存的外在条件，就有可能得到适合需求的微藻藻株；另外，通过诱变育种等方式也能直接得到符合要求的微藻藻株，这样一来，培养符合特定要求的微藻藻株，使其在环境、医药、食品等领域的利用更高效，就具有至关重要的意义。

传统的藻种培养方法主要是将藻种置于摇瓶中进行光照通气或者光照摇床培养，根据藻种的生长情况及脂含量、蛋白质含量等指标挑选出符合要求的藻株，但这种培养方法效率低下，存在大量人力物力的浪费，且在通气培养条件下，由于通气效果较难控制，较难保证每种藻株生长环境的一致性。

目前为止，已有一些微藻微型培养技术用于特定藻株的培养，以提高实验效率，但目前的微藻微型培养技术大多采用封闭式培养，不能进行通气培养，不能实现藻株与外界的气质交换，也不能确保其生长环境的稳定性，也不适于实现对烟道气耐受藻株的培养。

发明内容

本发明的目的是提供一种微藻快速筛选装置及微藻快速筛选方法，解决传统微藻培养装置不能实现藻株与外界的气质交换且效率低的问题。

具体的，本发明提供了一种微藻快速筛选装置，该装置包括培养缸、浮力装置、孔板和藻液培养管；培养缸设有玻璃盖，玻璃盖上方设置进气口和出气口，浮力装置设置于孔板下方，孔板上设置至少1个微藻培养孔，微藻培养孔用于放置藻液培养管，藻液培养管底部设有微孔。

进一步的，微孔的直径小于待培养的微藻的藻细胞直径。

进一步的，微藻培养孔的数量为32-100个。

进一步的，培养缸与玻璃盖的接合处设有磨砂玻璃。

进一步的，孔板与浮力装置可拆卸连接。

进一步的，藻液培养管可拆卸固定在藻液培养孔内。

进一步的，孔板中部设置通气孔，进气口通过玻璃管道与通气孔相连。

进一步的，培养缸、玻璃盖和藻液培养管均采用透明玻璃材质。

另外，本发明还提供了一种微藻快速筛选方法，包括如下步骤：

步骤1：将培养缸中添加培养液，将整个快速筛选装置在高压锅中灭菌、冷却备用；

步骤2：采用橡皮套圈将藻液培养管固定在孔板的藻液培养孔内，使橡皮套圈以下的藻液培养管浸入培养液，橡皮套圈以上的藻液培养管部分露在空气中；

步骤3：将藻菌落接入藻液培养管中进行培养后，将目的藻株通过酶标仪检测筛选出来。

进一步的，步骤3开始培养前，将藻株培养所需的气体通过进气口通入培养缸中。

与现有技术相比，本发明至少能实现以下有益效果之一：

(1)本发明提供的微藻快速筛选装置通过设置带有多孔的孔板，在筛选特定环境下的藻种时，能同时完成多种藻株的筛选，大大节约人力物力和实验材料，且只使用一个培养缸，大大节省空间。

(2)本发明提供的装置通过设置进气口、出气口和通气孔，可以实现藻株与外界的气质交换问题；通过在藻液培养管底部设有微孔，微孔的直径小于待培养的微藻的藻细胞直径，可以将藻细胞截留在管内，同时又能与培养液最大限度地进行物质交换；利用培养缸中大量的培养液避免藻种的通气培养时出现的水分散失严重问题，确保生长环境的稳定性，提高培养效率。

附图说明

附图仅用于示出具体实施例的目的，而并不认为是对本发明的限制，在整个附图中，相同的参考符号表示相同的部件。

图1是本发明的微藻快速筛选装置的整体结构示意图；

图2是本发明的孔板的俯视图；

图3是本发明的快速筛选装置装置的浮力装置、孔板与藻液培养管沿对称轴切开后的切面示意图；

图4a是本发明的实施例3中10个样本的生长曲线；

图4b是本发明的实施例3中10个样本的生物量数据两两进行T-检验分析的分析结果；

图5a是本发明的实施例4中藻株1在本发明的快速筛选装置、通气锥形瓶和通气试管中的生长曲线；

图5b是本发明的实施例4中藻株2在本发明的快速筛选装置、通气锥形瓶和通气试管中的生长曲线；

图5c是本发明的实施例4中藻株3在本发明的快速筛选装置、通气锥形瓶和通气试管中的生长曲线。

图中：1-玻璃盖；2-浮力装置；3-孔板；4-磨砂玻璃；5-进气口；6-培养缸；7-通气孔；8-藻液培养孔；9-出气口；10-藻液培养管；11-橡皮套圈。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例提供了一种微藻快速筛选装置，如图1-3所示，包括：培养缸6、浮力装置2、孔板3和藻液培养管10；培养缸6设有玻璃盖1，玻璃盖1上方设置进气口5和出气口9，浮力装置2设置于孔板3下方，孔板3上设置至少1个微藻培养孔8，微藻培养孔8用于放置藻液培养管10，藻液培养管10为上部开口的圆柱状，藻液培养管10的底部采用微孔玻璃材质。

具体的，微孔的直径小于待培养的微藻的藻细胞直径，可以将藻细胞截留在管内，同时又能与培养液最大限度地进行物质交换。

与现有技术相比，本实施例提供的微藻快速筛选装置通过设置带有多孔的孔板，在筛选特定环境下的藻种时，能同时完成多种藻株的筛选，大大节约人力物力和实验材料，且只使用一个培养缸，大大节省空间；通过设置进气口、出气口和通气孔，可以实现藻株与外界的气质交换问题；通过在藻液培养管底部设有微孔，微孔的直径小于待培养的微藻的藻细胞直径，可以将藻细胞截留在管内，同时又能与培养液最大限度地进行物质交换；实施时，利用培养缸中大量的培养液避免藻种的通气培养时出现的水分散失严重问题，确保生长环境的稳定性，提高培养效率。

具体的，微藻培养孔的数量为32-100个，例如96个，通过设置多个孔可以实现多种藻株的同时培养，大大节约人力物力和实验材料，大大降低成本。

具体的，孔板3的材料可以为耐高温、不易变形、比强度高、耐蚀性好的轻质材料，例如轻质铝板，轻质铝板密度小、耐高温、不易变形、比强度高、耐蚀性好，使用寿命长。

为了减少杂菌对培养缸中环境的污染，在培养缸与玻璃盖的接合处设置磨砂玻璃4，保证磨砂玻璃与培养缸与玻璃盖的接合处的气密性，同时磨砂玻璃也不易碎，安全可靠。

具体的，孔板3与浮力装置2可以通过连接装置可拆卸连接，例如通过螺栓连接，采用可拆卸连接方式可以保证在对孔板或浮力装置使用时直接进行连接，安装方便快捷，实施过程中，保证藻液培养管与下方培养液始终良好的接触；在对孔板或浮力装置进行更换时也方便快捷，节省时间，降低成本。

具体的，藻液培养管10可拆卸固定在藻液培养孔8内，例如采用橡皮套圈11将藻液培养管10固定在孔板藻液培养孔8内，这样可以根据使用需要选择合适的藻液培养管数量即可，不必造成实验材料的浪费，同时将藻液培养管10固定在藻液培养孔8内，可以避免实施过程中藻液培养管晃动，有利于实验的进行。

具体的，孔板3中部设置通气孔7，进气口5通过玻璃管道与通气孔7相连，实施时，微藻培养所需气体从进气口5进入，通过通气孔7进入到培养缸中，为微藻培养提供所需气体。

值得注意的是，为了实现微藻的光照培养，培养缸6、玻璃盖1和藻液培养管10均采用透明玻璃材质。

具体的，培养缸6的尺寸和大小没有特别限制，培养缸6内可根据需要盛放适宜体积的微藻培养液。为了适应通气搅拌及藻液培养的需要，培养缸6内培养液的体积应占其容积的1/2到2/3之间。

实施例2

本实施例提供了一种微藻快速筛选方法，采用上述实施例1的筛选装置，具体包括如下步骤：

步骤1：将培养缸中添加一定体积的培养液后，将整个快速筛选装置在高压锅中灭菌、冷却备用；

步骤2：采用橡皮套圈将藻液培养管固定在孔板的藻液培养孔内，使橡皮套圈以下的藻液培养管浸入培养液，而橡皮套圈以上的藻液培养管部分露在空气中；

步骤3：将藻菌落接入藻液培养管中进行培养后，将目的藻株通过酶标仪检测筛选出来。

具体的，步骤3开始培养前，将藻株培养所需的气体通过进气口通入培养缸中。

实施例3

本实施例提供了一种微藻快速筛选方法，通过对孔板不同部位微藻生长情况的测定，来评价本装置中孔板中的样本是否具有平行性，本实施例中选用的藻种是小球藻，采用上述实施例1的筛选装置，具体包括如下步骤：

步骤1：标准曲线的绘制：先将小球藻藻种植于摇瓶中预培养7天，再离心去上清，将得到的藻细胞沉淀在-40℃下冷冻干燥24小时制得干藻粉；将干藻粉用蒸馏水稀释至一定的浓度梯度，于570nm波长处测量吸光值，建立干重与OD₅₇₀值的一元线性回归方程，其线性回归方程为：y＝1105.1x+0.0038(R²＝0.9983)，其中x表示细胞干重(g/mL)，y表示OD₅₇₀，R²为斜率系数。

步骤2：培养基的配制：本实施例中小球藻的培养采用BG-11培养基，每升培养基中含有1.5gNaNO₃、0.04gK₂HPO₄、0.075gMgSO₄·7H₂O、0.036gCaCl₂·2H₂O、0.006g柠檬酸、0.006g柠檬酸铁铵、0.001gEDTANa₂、1.0mL微量元素A5和999mL蒸馏水；其中，每升A5微量元素含有2.86gH₃BO₄、1.81gMnCl₂·4H₂O、0.222gZnSO₄、0.39gNa₂MoO₄·2H₂O、0.079gCuSO₄·5H₂O、0.049gCo(NO₃)₂·6H₂O。

步骤3：小球藻的预培养：将小球藻接种于200毫升BG-11培养基中在光照条件下进行摇瓶培养，温度为28℃，转速为180r/min。

步骤4：孔板样本平行性的验证：本实施例中空板上设置96个孔，在孔板不同位置均匀选取10个样本，每相邻4个藻液培养管为一个样本并分别编号；将BG-11培养液倒入培养缸中至2/3容积处，分别吸取步骤3中预培养至第六天(对数期)的小球藻50微升(根据藻液培养管的装液量保证10％左右的接种量)接种至藻液培养管中，每隔一天吸取每个样本中的一个培养管中的藻液200微升于酶标板中，测量其在570nm波长处的吸光值。

步骤5：数据分析：利用步骤1中作的标准曲线，将步骤4中所测得的吸光值换算为细胞干重，绘制不同样本中小球藻的生长曲线，如图4a所示，从图中可以看出，在孔板不同位置选的10个样本中的小球藻，其生长情况有较小的差异性；再对这10组数据两两进行T-检验分析，分析结果见图4b，可以发现其中p＜0.05的个数为2个，小于总共T-检验次数(45)的5％。因此，孔板的平行样本之间不存在显著性差异，绝大部分微藻培养孔对应的藻液培养管都可以用于微藻的培养。

实施例4

在本实施例中，通过对本发明装置与传统的通气锥形瓶、通气试管对不同藻种筛选结果的比较，评定本装置对不同藻种的筛选结果是否具有可靠性，具体实施步骤如下：

步骤1：标准曲线的绘制与原始藻株的预培养：本步骤与实施例3中的步骤1-3相同，以小球藻作为原始藻株，培养基选用BG-11培养基。

步骤2：原始藻株的诱变培养：吸取步骤1中预培养至第六天(对数期)的原始藻株5mL左右于培养皿上，使藻液平铺在培养皿底部并敞口置于紫外灯下照射20min左右，再将诱变后的藻液稀释100倍后涂布在含有固体培养基的培养皿上(固体培养基的配方为：每升固体培养基含有1.5gNaNO₃、0.04gK₂HPO₄、0.075gMgSO₄·7H₂O、0.036gCaCl₂·2H₂O、0.006g柠檬酸、0.006g柠檬酸铁铵、0.001gEDTANa₂、20g琼脂粉、1.0mL微量元素A5和999mL蒸馏水；其中，每升A5微量元素含有2.86gH₃BO₄、1.81gMnCl₂·4H₂O、0.222gZnSO₄、0.39gNa₂MoO₄·2H₂O、0.079gCuSO₄·5H₂O、0.049gCo(NO₃)₂·6H₂O)，原始藻株稀释10000倍后涂布在固体培养基上，将其在温度为28℃的光照条件下进行培养。

步骤3：诱变藻株的扩培：将步骤2中的诱变藻株和原始藻株培养一周左右，能观察到明显的单菌落时，用接种环挑取诱变藻株中长势不同的两种菌落及原始藻株的菌落，并分别将其接种到含有BG-11培养基的摇瓶中进行扩培，设置温度为28℃，转速为180r/min。

步骤4：利用本发明实施例1中的装置培养考察不同藻种的生物量变化：将步骤3中的3种扩培后的藻株(藻株1、藻株2和藻株3)每种藻株做三个平行样本，为了测量的需要，每个样本设置六根藻液培养管，将BG-11培养液倒入培养缸中至2/3容积处，分别吸取步骤3中培养至第六天(对数期)的3种藻株的藻液50微升(根据藻液培养管的装液量保证10％左右的接种量)接种至藻液培养管中进行光照及通气培养，并设置温度为28℃；每天吸取每个样本中的一个培养管中的藻液200微升于酶标板中，测量其在570nm波长处的吸光值，共测量6天。

具体的，作为对比例，本实施例中利用通气锥形瓶及通气试管培养考察不同藻种的生物量变化：将步骤3中培养至第六天(对数期)的3种藻的藻液按照10％的接种量分别接种到通气锥形瓶及通气试管中进行光照及通气培养，控制一定的通气速率，并设置温度为28℃，每种藻株做三个平行样本，每天吸取每个样本中的藻液200微升于酶标板中，测量其在570nm波长处的吸光值，共测量六天。

步骤5：数据分析：利用步骤1中所作标准曲线的一元线性回归方程将步骤4中测量得到的OD值换算成细胞干重，并分别绘制藻株1、藻株2和藻株3在通气锥形瓶、通气试管及本发明快速筛选装置中的细胞生长曲线，如图5a-5c所示。数据取平行样本的平均值。

从图5a-5c中可以看出3种藻株在本发明快速筛选装置及通气锥形瓶、通气试管中的生长情况具有较好的一致性，利用本装置进行不同藻株的筛选，其结果具有可靠性。

综上所述，本发明的装置在筛选特定环境下的藻种时，能同时完成多种藻株的筛选，大大节约人力物力和实验材料；例如，若筛选适应烟道气生长的诱变藻株，在每种藻做三个平行样的情况下，利用传统的通气锥形瓶筛选方法则需要9个锥形瓶，每次取样测量完还要分别重新连接管道进行通气，而若利用本装置进行筛选，则只需要一个孔板和相应数量的藻液培养管，大大节省占用的空间，且取样测量完之后只需要连接一个通气管道即可，大大节省了实验时间，同时保证了每种藻株在筛选过程中生长环境的一致性。

由于在进行藻种的通气培养时会出现水分散失严重，从而影响藻细胞生长的情况，而本发明装置则利用培养缸中大量的培养液很好地解决了这一问题；目前的微藻微型培养装置大多是封闭型的，在对不同种类或浓度的气体适应性微藻进行筛选时，只能将气体封存在微孔板中，而本装置则实现了能直接与外界进行气体交换的微藻微型培养。

综上所述，本发明装置可通过对微藻的微型培养，快速筛选出特定环境下的多种微藻株，筛选结果可靠，同时，与传统的通气锥形瓶、通气试管的筛选方法相比，大大节约了人力物力，能有效提高筛选效率。

尽管已经结合优选的实施例对本发明进行了详细地描述，但是本领域技术人员应当理解的是在不违背本发明精神和实质的情况下，各种修正都是允许的，它们都落入本发明的权利要求的保护范围之中。