微拟球藻诱变育种及高脂藻株筛选方法研究

摘要

随着世界经济发展，化石能源消耗日益加剧，环境问题不断凸显。为推进经济社会可持续发展，必须加快转变发展方式、优化能源结构，开发资源节约、环境友好的新型能源。微藻是水域生态系统的初级生产者，具有种类繁多、结构简单、生长迅速以及含油量高等特点，近年来，利用微藻制备生物柴油已成为全世界研究的焦点。但是，由于多方面原因，微藻制备生物柴油至今仍未能实现工业化生产，其制约因素之一是缺乏优良的种质资源。微拟球藻（Nannochloropsis oceanica）生长速度快、油脂含量高、抗逆性强，是极具开发潜力的优良藻种。
　　本文以研究室保存的微拟球藻（N.oceanica）藻种（编号为CS-179）为材料，经过分离纯化开展了诱变育种研究，得出以下结果：
　　1.研究了乙酰辅酶 A羧化酶抑制剂类除草剂精喹禾灵筛选高脂微藻的可行性，发现7.5mmol/L精喹禾灵可抑制99.7％的微拟球藻生长，10mmol/L精喹禾灵完全抑制微拟球藻生长，确定了其有效性。以7.5mmol/L精喹禾灵筛选获得两个藻株KA1和KA2，经52天培养后，其总脂含量分别达干重的46.73%和38.60%，比出发藻株分别提高了29.02%和6.57%。KA1的比生长速率和终生物量与出发藻株无显著差异,但其油脂产率比出发藻株显著升高。
　　2.利用浓度为50mM的化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）对微拟球藻进行诱变处理，并用精喹禾灵作为筛选压进行高脂诱变藻株筛选，获得了 KE75B1和KE10A1两个高脂藻株，其总脂含量分别占细胞干重的44.19%和43.51%，比出发藻株（总脂含量占细胞干重的39.34%）分别提高了12.35%和10.62%（P<0.05），且KE75B1藻株的油脂产率也较出发藻株提高18.07%（P<0.05）。
　　3.探索了尼罗红微波助染法筛选高脂微拟球藻诱变藻株的有效性，结果表明：利用DMSO预处理样品，在微波加热45s和15s时，尼罗红染色的效果最佳。以此方法筛选获得了三株荧光强度较出发藻株显著提高的诱变藻株，经氯仿-甲醇提总脂法进行验证，诱变藻株E232和E234的总脂含量占其细胞干重的百分比分别较出发藻株提高了13.04%和16.39%（P<0.05），诱变藻株 E225虽然差异不显著（P>0.05），但也较出发藻株升高了10.78%，证明了该高通量筛选方法的可行性。
　　综上所述，本研究证明了以甲基磺酸乙酯（EMS）进行高脂微拟球藻诱变育种的有效性，确定了精喹禾灵作为筛选压筛选高脂微拟球藻的可行性，探明了尼罗红微波助染高通量筛选高脂微拟球藻的基本条件，为发展微拟球藻诱变育种提供了参考。

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第一章 前言 综述-生物柴油研究进展及微藻诱变育种概述

1.化石能源

2.生物柴油

3.诱变育种

4.高脂微藻筛选方法

第二章 精喹禾灵筛选高脂微拟球藻有效性研究

1前言

2. 微拟球藻分类地位及形态特征2.1 分类地位

3微拟球藻藻种来源及培养

6细胞计数与细胞光密度值（OD值）之间关系6.1试剂与仪器

7.精喹禾灵对高脂微拟球藻筛选有效性研究7.1 材料与仪器

第三章精喹禾灵在EMS诱变高脂藻株筛选中的应用

前言

1.材料与方法1.1藻种

2 结果与分析2.1EMS致死率

3 讨论

第四章 高脂微拟球藻诱变藻株的高通量筛选

前言

1材料与方法1.1藻种

2结果与分析

2.1微波助尼罗红染色时间优化结果2.1.1 DMSO预处理微波炉加热时间的优化结果

2.4高脂抗性诱变藻株及其评价

3 讨论

总结与展望

1 工作总结

2工作展望

参考文献

致谢

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