荷斯坦牛热应激耐受能力的分子标记及检测方法

摘要

本发明公开了一种检测荷斯坦牛热应激耐受能力的分子标记及检测方法。本发明提供了用于检测荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C的物质如下任一中的应用：(A)鉴定或辅助鉴定荷斯坦牛热应激耐受能力；(B)选育热应激耐受能力相对较高的荷斯坦牛群体。本发明操作简单，仅需获得个体基因组便可自动化上机检测，获得个体的基因型，从而知晓该个体的抗热能力，费用低，精确性高，省时省力。总之，使用本发明中PHRF1基因的T2029C位点CC基因型对荷斯坦牛耐热能力进行选择时，可使荷斯坦牛的耐热能力得到提高。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种荷斯坦牛热应激耐受能力的分子标记及检测方法。

背景技术

目前，全球气候的持续变暖对人类发展、动物生存和生态平衡造成了威胁。日趋严重的热应激影响了畜禽的生产性能、繁殖性能及抗病能力，制约了畜牧业的持续发展。奶牛的汗腺不发达，散热能力差，且产奶过程中也会产生大量热量，导致奶牛对热应激尤为敏感。据报道，热应激引起的奶牛产奶量下降可导致整个美国乳制品行业每年损失12亿美元，德国奶牛养殖业每年的经济损失也超过了10％。我国国土面积的四分之一是亚热带地区，夏季气温可普遍升高至27～30℃，有研究表明，我国上海市、北京市，甚至哈尔滨市三个地区夏季的奶牛均发生了不同程度的热应激，产奶量下降幅度高达28％，造成了奶牛养殖业的巨大经济亏损。国内外多数牛场通过在牛舍环境中增加降温设备(如风扇和喷淋)来缓解炎热天气对奶牛的影响，然而，这些设备不但增加了奶牛养殖的投入，还可能会对奶牛饲养、疾病控制及繁殖性能造成不利影响，因此仅通过环境控制无法有效地解决奶牛的热应激问题，对奶牛进行耐热能力的选育才是长效之计。

评价奶牛热应激反应常用的方法是检测与温度调节相关的性状，包括直肠温度(Rectal temperature)、呼吸频率(Respiratory rate)及流涎指数(Drooling score)。奶牛直肠温度的变化代表动物体内的温度变化，反映了动物维持热平衡的能力，直肠温度的遗传力估计值为0.15～0.31，属于中等遗传力。呼吸频率是评价奶牛热应激程度的另一表型，当温度从等温区上升到32℃以上时，奶牛呼吸频率则从20次/min上升到 100次/min，甚至更高。奶牛呼吸频率的遗传力较高，估计值为0.76～0.84。此外，当奶牛处于热应激时，其采食量下降，瘤胃反刍活动量下降，唾液分泌减少，且奶牛通过张嘴喘气进行散热，将伴随流涎，故在夏季观察奶牛的流涎情况，通过评分将其量化，也可衡量奶牛热应激的反应程度。在奶牛热应激反应的众多性状中，直肠温度的测量是最简单易行的，因此是奶牛热应激研究中常用的表型性状。

然而，众所周知，这些表型在热应激下存在个体差异，胎次、泌乳天数、妊娠天数及挤奶前后都对奶牛的热应激反应具有影响，仅通过这些表型去判定奶牛耐热能力会较高的假阳性和假阴性，且在大群中测量这些生理指标的工作量大，费时费力。随着分子遗传学和生物技术的高速发展，大量以分子遗传标记为形式的DNA遗传信息被发现，包括限制性酶切片段长度多态性、微卫星以及单核苷酸多态等。通过这些标记，我们能从DNA水平上进行分析，获得目标性状的遗传部分，并进行个体选择。与传统选择策略相比，通过分子标记选择具有明显的优势，不仅可以提高选择的准确性，并且仅需获得该个体的基因组即可，不需进行表型测定，可以在动物出生时即可预测，从而缩短世代间隔，大大的提高遗传进展。

目前，国内外对奶牛热应激耐受性的DNA分子标记研究较少，仍缺乏热应激条件下与奶牛生产性能和生理性状相关联的数量性状基因座，仅有少数研究报道了可作为奶牛抗热应激的潜在遗传标记。此外，随着全球变暖形势的加剧，在平衡育种理念下，提高奶牛热应激耐受性至关重要，可使得牛群对未来气候有更好的适应性。因此，定位与奶牛热应激相关的数量性状基因座和筛选可鉴定其个体耐热性的DNA分子标记，不仅可避免表型测定时的繁琐，还可提高选择准确性，缩短时代间隔，获得更快的遗传进展，对有效选择奶牛中的热耐受个体和选育热耐受能力较高的奶牛群体具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测荷斯坦牛热应激耐受能力的分子标记及检测方法。

第一方面，本发明要求保护用于检测荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C的物质如下任一中的应用：

(A)鉴定或辅助鉴定荷斯坦牛热应激耐受能力；

(B)选育热应激耐受能力相对较高的荷斯坦牛群体。

其中，所述热应激耐受能力相对较高，指的是：与基因组中PHRF1基因的cDNA 序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体或者是T和C的杂合体的荷斯坦牛相比，基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体荷斯坦牛的热应激耐受能力更高。

第二方面，本发明要求保护用于检测荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C的物质在如下任一中的应用：

(C)鉴定或辅助鉴定热应激下荷斯坦牛直肠温度的高低；

(D)选育热应激下直肠温度相对较低的荷斯坦牛群体；

(E)鉴定或辅助鉴定热应激下荷斯坦牛呼吸评分的高低；

(F)选育热应激下呼吸评分相对较低的荷斯坦牛群体；

(G)鉴定或辅助鉴定热应激下荷斯坦牛流涎指数的高低；

(H)选育热应激下流涎指数相对较低的荷斯坦牛群体；

(I)鉴定或辅助鉴定热应激下荷斯坦牛所产牛奶中体细胞数的高低；

(J)选育热应激下所产牛奶中体细胞数相对较低的荷斯坦牛群体。

在第一方面和第二方面中，所述用于检测荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA 序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C的物质可为成套引物或含有所述成套引物的试剂或试剂盒或引物对或含有所述引物对的试剂或试剂盒。

所述成套引物中含有两条上游引物和一条下游引物。所述上游引物根据所述荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为所述荷斯坦牛基因组中 PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸C，另一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为所述荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸T；所述下游引物根据所述荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计。

所述引物对为由SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的两条单链DNA分子组成的引物对。

进一步地，所述成套引物为由SEQ ID No.1的第22-42位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ ID No.2的第22-41位所示的单链DNA分子或其衍生物和SEQ ID No.3 所示的单链DNA分子组成的成套引物。

更进一步地，所述SEQ ID No.1的第22-42所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ IDNo.1的第22-42位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光序列A。所述SEQ ID No.2的第22-41位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.2的第22-41位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光序列B。

在所述试剂或试剂盒中，还可含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B。

所述荧光探针A为与所述特异荧光序列A一致的序列，5’末端连接荧光报告基团A；所述淬灭探针A为所述特异荧光序列A的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团。

所述荧光探针B为与所述特异荧光序列B一致的序列，5’末端连接荧光报告基团B；所述淬灭探针B为所述特异荧光序列B的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团。

进一步地，所述特异荧光序列A和所述特异荧光序列B，其一为荧光序列FAM，另一为荧光序列HEX；所述荧光报告基团A和所述荧光报告基团B，其一为FAM，另一为HEX；所述荧光淬灭基团为BHQ。

第三方面，本发明要求保护如下任一方法：

方法A：一种检测荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C的方法。该方法可包括如下步骤(A1)或(A2)：

(A1)直接测序；如用前文第一和第二方面中所述的引物对SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5对荷斯坦牛基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物后直接进行Sanger测序；

(A2)用前文第一和第二方面中所述的成套引物的试剂或试剂盒对荷斯坦牛基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物，将所述PCR产物用荧光阅读仪读取荧光信号，然后按照如下所述确定荷斯坦牛基因中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C：

若所述PCR产物仅显示SEQ ID No.1所示的单链DNA分子5'端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色，则所述荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体；

若所述PCR产物仅显示SEQ ID No.2所示的单链DNA分子5'端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色，则所述待荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA 序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体；

若所述PCR产物显示SEQ ID No.1所示的单链DNA分子5'端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色和SEQ ID No.2所示的单链DNA分子5'端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色，则所述荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA 序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T和C的杂合体。

在本发明的具体实施方式中，上述第一和第二方面中所述特异荧光序列A具体为荧光序列FAM；所述特异荧光序列B具体为荧光序列HEX；所述荧光序列FAM具体为SEQ IDNo.1的第1-21位；所述荧光序列HEX具体为SEQ ID No.2的第1-21位(即所述成套引物具体为由SEQ ID No.1所示的单链DNA分子、SEQ ID No.2所示的单链 DNA分子和SEQ ID No.3所示的单链DNA分子组成的成套引物)。相应的，所述荧光报告基团A具体为FAM，所述荧光报告基团B具体为HEX。

相应的，在第三方面中的所述方法A的步骤(A2)中，若所述PCR产物显示蓝色，则所述荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体；若所述PCR产物显示红色，则所述荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的 cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体；若所述PCR产物显示绿色，则所荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T和 C的杂合体。

方法B：一种鉴定或辅助鉴定荷斯坦牛热应激耐受能力的方法。该方法可包括如下步骤：

(B1)检测荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C；

(B2)按照如下确定荷斯坦牛的热应激耐受能力：基因组中PHRF1基因的cDNA 序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体的荷斯坦牛的热应激耐受能力强于基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T和C的杂合体或者是T的纯合体的荷斯坦牛。

方法C：一种选育热应激耐受能力相对较高的荷斯坦牛群体的方法。该方法可包括如下步骤：

(C1)检测荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C；

(C2)选择基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C 的纯合体荷斯坦牛作为亲本进行选育，得到热应激耐受能力相对较高的荷斯坦牛群体。

其中，所述热应激耐受能力相对较高，指的是：与基因组中PHRF1基因的cDNA 序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体或者是T和C的杂合体的荷斯坦牛相比，基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体荷斯坦牛的热应激耐受能力更高。

方法D：一种鉴定或辅助鉴定热应激下荷斯坦牛直肠温度高低的方法。该方法可包括如下步骤：

(D1)检测荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C；

(D2)按照如下确定热应激下荷斯坦牛直肠温度的高低：基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体的荷斯坦牛的直肠温度低于基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T和C的杂合体的荷斯坦牛的直肠温度；基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T和C的杂合体的荷斯坦牛的直肠温度低于基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体的荷斯坦牛的直肠温度。

方法E：一种选育热应激下直肠温度相对较低的荷斯坦牛群体的方法。该方法可包括如下步骤：

(E1)检测荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C；

(E2)选择基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C 的纯合体的荷斯坦牛作为亲本进行选育，得到热应激下直肠温度相对较低的荷斯坦牛群体。

其中，所述热应激下直肠温度相对较低，指的是：与基因组中PHRF1基因的cDNA 序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体或者是T和C的杂合体的荷斯坦牛相比，基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体荷斯坦牛热应激下直肠温度更低。

方法F：一种鉴定或辅助鉴定热应激下荷斯坦牛呼吸评分高低的方法。该方法可包括如下步骤：

(F1)检测荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C；

(F2)按照如下确定荷斯坦牛热应激下呼吸评分的高低：基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体的荷斯坦牛的呼吸评分低于基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体或者是 T和C的杂合体的荷斯坦牛的呼吸评分。

方法G：一种选育热应激下呼吸评分相对较低的荷斯坦牛群体的方法。该方法可包括如下步骤：

(G1)检测荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C；

(G2)选择基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C 的纯合体荷斯坦牛作为亲本进行选育，得到热应激下呼吸评分相对较低的荷斯坦牛群体。

其中，所述热应激下呼吸评分相对较低，指的是：与基因组中PHRF1基因的cDNA 序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体或者是T和C的杂合体的荷斯坦牛相比，基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体荷斯坦牛热应激下呼吸评分更低。

方法H：一种鉴定或辅助鉴定热应激下荷斯坦牛流涎指数高低的方法。该方法可包括如下步骤：

(H1)检测荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C；

(H2)按照如下确定热应激下荷斯坦牛流涎指数的高低：基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体的荷斯坦牛的流涎指数低于基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体或者是 T和C的杂合体的荷斯坦牛的流涎指数。

方法I：一种选育热应激下流涎指数相对较低的荷斯坦牛群体的方法。该方法可包括如下步骤：

(I1)检测荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C；

(I2)选择基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C 的纯合体荷斯坦牛作为亲本进行选育，得到热应激下流涎指数相对较低的荷斯坦牛群体。

其中，所述热应激下流涎指数相对较低，指的是：与基因组中PHRF1基因的cDNA 序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体或者是T和C的杂合体的荷斯坦牛相比，基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体荷斯坦牛热应激下流涎指数更低。

方法J：一种鉴定或辅助鉴定热应激下荷斯坦牛所产牛奶中体细胞数高低的方法。该方法可包括如下步骤：

(J1)检测荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C；

(J2)按照如下确定热应激下荷斯坦牛所产牛奶中体细胞数的高低：基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体的荷斯坦牛所产牛奶中体细胞数低于基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体的荷斯坦牛所产牛奶中体细胞数。

方法K：一种选育热应激下所产牛奶中体细胞数相对较低的荷斯坦牛群体的方法。该方法可包括如下步骤：

(K1)检测荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C；

(K2)选择基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C 的纯合体荷斯坦牛作为亲本进行选育，得到热应激下所产牛奶中体细胞数相对较低的荷斯坦牛群体。

其中，所述热应激下所产牛奶中体细胞数相对较低，指的是：与基因组中PHRF1 基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体的荷斯坦牛相比，基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体荷斯坦牛热应激下所产牛奶中体细胞数更低。

进一步地，在所述方法B、所述方法C、所述方法D、所述方法E、所述方法F、所述方法G、所述方法H、所述方法I、所述方法J和所述方法K中，所述检测荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是 T和C的方法均可为所述方法A。

第四方面，本发明要求保护具有如下(A)-(J)中至少一种功能的物质：

(A)鉴定或辅助鉴定荷斯坦牛热应激耐受能力；

(B)选育热应激耐受能力相对较高的荷斯坦牛群体；

(C)鉴定或辅助鉴定热应激下荷斯坦牛直肠温度的高低；

(D)选育热应激下直肠温度相对较低的荷斯坦牛群体；

(E)鉴定或辅助鉴定热应激下荷斯坦牛呼吸评分的高低；

(F)选育热应激下呼吸评分相对较低的荷斯坦牛群体；

(G)鉴定或辅助鉴定热应激下荷斯坦牛流涎指数的高低；

(H)选育热应激下流涎指数相对较低的荷斯坦牛群体；

(I)鉴定或辅助鉴定热应激下荷斯坦牛所产牛奶中体细胞数的高低；

(J)选育热应激下所产牛奶中体细胞数相对较低的荷斯坦牛群体。

所述物质为前文第一和第二方面中所述的用于检测荷斯坦牛基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C的物质。

第五方面，本发明要求保护前文所述的方法或所述的物质在选育具有如下性状中至少一种的荷斯坦牛群体中的应用：

(a)热应激耐受能力相对较高；

(b)热应激下直肠温度相对较低；

(c)热应激下呼吸评分相对较低；

(d)热应激下流涎指数相对较低；

(e)热应激下所产牛奶中体细胞数相对较低。

其中，(a)-(e)的具体含义见前文。

在本发明的具体实施方式中，所述热应激具体为：根据NY/T 2363-2013，当牛舍平均温湿度指数72≤THI≤79时，荷斯坦牛处于轻度热应激状态；当牛舍平均温湿度指数78＜THI≤88时，荷斯坦牛处于中度热应激状态；当牛舍平均温湿度指数＞88时，荷斯坦牛处于重度热应激状态。

在本发明的具体实施方式中，所述荷斯坦牛具体为中国荷斯坦牛。

在本发明中，所述直肠温度、所述呼吸评分、所述流涎指数和所述所产牛奶中的体细胞数的高低均是以对应指标的直接测量值或估计育种值(EBV)的大小所体现的。

在本发明中，所述呼吸评分标准如下：正常呼吸，呼吸评分为1分；呼吸频率为 80-120次/分，呼吸评分为2分；呼吸频率大于120次/分，呼吸评分为3分。更加具体的，所述呼吸评分标准详见实施例3中表7。

在本发明中，所述流涎指数的评分标准如下：无流涕和流涎，流涎评分为1分；涎水呈丝状悬挂或水状滴落，流涎评分为2分；涎水或鼻涕成股下流，流涎评分为3 分。更加具体的，所述流涎指数的评分标准详见实施例3中表8。

试验结果证明，当被测荷斯坦牛个体基因组中PHRF1基因的cDNA序列第2029 位(命名为T2029C)的基因型为CC时，其热应激下直肠温度、呼吸评分及流涎指数的估计育种值(EBV)最低，其EBV分别为-0.0014±0.0036，-0.0040±0.0038，-0.0210±0.0026，与CT基因型和TT基因型比较均具有显著性差异(P<0.05)。当被测荷斯坦个体T2029C位点的基因型为CT时，其热应激下直肠温度、呼吸评分及流涎指数的EBV分别为0.0284±0.0042，0.0180±0.0040和-0.0074±0.0031，仅直肠温度与TT 基因型具有显著性差异(P<0.05)。当被测个体T2029C位点的基因型为TT时，其热应激下直肠温度、呼吸评分及流涎指数的EBV最高，其EBV分别为0.0471±0.0120， 0.0217±0.0126，-0.0070±0.0089。此外，当比较T2029C位点各基因型个体生产性能的 EBV时，发现CC基因型、CT基因型及TT基因型之间在热应激下的产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量及乳蛋白率均无显著差异(P>0.05)，其CC基因型个体中各项性能的EBV分别为1241.0163±26.1129，18.8342±0.8595，0.1448±0.0070，35.54404±0.7738， 0.2835±0.0059；CT基因型个体中各项性能的EBV分别为1290.2917±30.7298， 21.0747±1.0114，0.1632±0.0082，37.7459±0.9107，0.3020±0.0070；TT基因型个体中 1314.6641±87.7318，22.5020±2.8876，0.1730±0.0234，37.6339±2.5999，0.3003±0.0200。当比较T2029C位点各基因型个体在热应激下牛奶中体细胞数的EBV时，三者具有显著性差异(P<0.05)，其中CC基因型个体牛奶中体细胞数的EBV最低，为 0.0864±0.0086，与TT基因型具有显著差异(P<0.05)，与CT基因型个体无显著性差异(P>0.05)。CT基因型个体与TT基因型个体热应激下牛奶中体细胞数的EBV分别为0.1075±0.0101，0.1549±0.0290，二者无显著性差异(P>0.05)。因此，在热应激下， T2029C位点的CC基因型个体不仅具有更低的直肠温度，较高的产奶性能，且牛奶中的体细胞数也更低。同时，本发明采用荷斯坦牛外周血单个核细胞作为热应激细胞模型，通过体外培养的方式，检测了CC基因型与TT基因型个体外周血单个核细胞在不同程度热应激下PHRF1基因mRNA的表达情况，发现CC基因型和TT基因型个体的外周血单个核细胞经过热处理后，随着温度的升高PHRF1基因表达量均呈上升趋势，其中二者外周血单个核细胞中PHRF1基因的表达量在37℃(对照组)条件下无显著差异；二者外周血单个核细胞中PHRF1基因的表达量在39℃(轻度热应激组)下有极显著差异(P<0.01)，且TT基因型个体中PHRF1基因的表达量高于CC基因型个体；二者外周血单个核细胞中PHRF1基因的表达量在42℃条件下(重度热应激组)无差异(P>0.05)。

本发明提供了一种可检测荷斯坦牛热应激耐受能力的单核苷酸多态，并提供了可检测该位点基因型的普通PCR引物和竞争性等位基因特异性PCR引物，可快速检测待测个体的基因型。由于T2029C位点CC基因型个体具有较低的直肠温度、呼吸评分及流涎指数，较低的体细胞数，且不影响其产奶量、乳蛋白等产奶性能，因此可作为优势基因型对荷斯坦牛的耐热能力进行选择，为荷斯坦牛标记辅助选育耐热群体提供了一种更为有效、简单易操作、多态信息量高的分子遗传标记，为荷斯坦牛的耐热能力改良提供了一种有效的分子标记手段，为加快育种进程奠定了基础。本发明操作简单，仅需获得个体基因组便可自动化上机检测，获得个体的基因型，从而知晓该个体的抗热能力，费用低，精确性高，省时省力。总之，使用本发明中T2029C位点 CC基因型对荷斯坦牛耐热能力进行选择时，可使荷斯坦牛的耐热能力得到提高。

附图说明

图1为中国荷斯坦牛上、下午直肠温度估计育种值(EBVs)全基因组关联分析的 QQ图及曼哈顿图。

图2为公牛DNA混池测序中T2029C位点的峰图。

图3为采用竞争性等位基因特异性PCR法检测T2029C位点不同基因型的分布情况。

图4为T2029C位点不同基因型荷斯坦牛个体的外周血单个核细胞在不同程度热应激下PHRF1基因mRNA的表达情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、热应激条件下荷斯坦牛直肠温度的全基因组关联分析

1、直肠温度的测定

2013年至2015年，每年夏季(6～8月份)测定北京地区9个牧场中荷斯坦泌乳牛热应激状态下的直肠温度，共6,446头。测定时间：上午7:00～10:00和下午14:00～17:00 (测定时间内，根据NY/T 2363-2013，当牛舍平均温湿度指数72≤THI≤79时，荷斯坦牛处于轻度热应激状态；当牛舍平均温湿度指数78＜THI≤88时，荷斯坦牛处于中度热应激状态；当牛舍平均温湿度指数＞88时，荷斯坦牛处于重度热应激状态)，每头牛每天测定两次直肠温度，记为上午直肠温度和下午直肠温度，连续测定两天。测定方法：测定时牛位于颈枷下，将电子体温计(OMRON欧姆龙)插入荷斯坦牛直肠 10cm，待10_s读数稳定后拔出，读取结果(精确至0.1℃)。

2、上、下午直肠温度的估计育种值(EBV)

考虑到奶牛的生物节律，将直肠温度表型数据分为上午和下午两个性状分别研究。采用二性状动物模型：

Y_ijklm＝u+FYP_i+PARITY_j+STAGE_k+M_l+b₁TEM+A_m+PE_m+ε_ijklm

(模型Ⅰ)

Y_ijklm为上午或下午直肠温度，FYP_i是场年效应，PARITY_j为胎次效应，STAGE_k为泌乳阶段效应，M_l为挤奶状态效应，b₁为温度协变量的回归系数，TEM为环境温度，A_m为个体加性随机效应，PE_m为永久随机环境效应，ε_ijklm为随机残差。

使用DMU(Version：6，Release：5.2)软件计算性状的估计育种值(EBV)。计算过程中，利用平均信息约束估计最大似然法(AI-REML法)求解混合线性方程组 (MME)获得性状的方差组分和协方差组分估值，并获得每个个体上午和下午直肠温度的估计育种值(EBV)。

3、上、下午直肠温度EBV的全基因组关联分析

从上述群体中，随机挑选1,114头荷斯坦泌乳牛作为研究对象，采用尾根静脉采血法收集约10mL抗凝血液，制作血斑卡，使用QIAGEN试剂盒提取基因组(货号： 51106)，后续使用来自Illumina公司的150K SNP芯片(货号GGP Bovine HD)进行基因型分型。使用BEAGLE软件对所获得的芯片数据进行填充和质控，满足如下条件的SNP删除：1)最小等位基因频率≤5％；2)哈迪温伯格平衡检验P值＜1.00×10^-6)；>-7。分析结果显示，在基因组水平上(α＝0.05)分别找到8个与上午直肠温度，2个与下午直肠温度显著相关的>

表1与荷斯坦牛上、下午直肠温度EBV显著相关的SNPs及候选基因

实施例2热应激耐受相关候选基因的筛选及多态性挖掘

为了找到可能与热应激耐受能力相关的候选基因，选择显著SNPs附近上、下游各200kb区域作为候选区域，进行基因的筛查，共找到了5个可能与上午直肠温度 EBV相关的候选基因(表1)。通过查阅文献发现，PHRF1基因所编码产生的蛋白富含Ser/Arg结构域，该区域与RNA聚合酶II大亚基的C末端结合，可通过调节DNA 损伤后的非同源末端连接来促进基因组完整性，因此，我们推测PHRF1是最可能的功能候选基因。为了进一步验证PHRF1基因作为候选基因的可能性，对其多态性进行了筛查并进行了其与性状的关联分析。

1、公牛冻精基因组DNA提取

(1)取2mL离心管，放入一支冻精，加入500μL生理盐水，涡旋混匀，12,000 rpm离心1min，弃上清，保留沉淀；

(2)重新加入500μL生理盐水，重复步骤(1)一次；

(3)加入400μL含有DTT的牛冻精裂解液(0.5mol/L的EDTA 2mL，1mol/L 的Tris-HCl 1mL，10％的SDS 10mL，0.29g NaCl，0.77g DTT，加双蒸水定容到80 mL)，再加入100μL20％的SDS，放置一会儿后涡旋，使沉淀完全溶于液体中，再加入10μL的蛋白酶K(20ng/mL)，颠倒混匀；

(4)56℃水浴，20～22h；

(5)取消化好的样品，加入300μL饱和食盐水，颠倒混匀后放入4℃静置1～2min， 4℃，12,000rpm离心10min，取上清移到新离心管中，弃沉淀；

(6)加入1,000μL预冷的无水乙醇，颠倒混匀后，12,000rpm离心2min，弃上清，保留DNA沉淀；

(7)加入500μL 75％乙醇，颠倒混匀后，12,000rpm离心2min，弃上清，保留 DNA沉淀；

(8)重复步骤(7)一次，然后开盖放置2～3min，挥发残余乙醇；

(9)加入300μL 56℃预热的TB，4℃过夜；

(10)用NanoDrop2000紫外分光光度计和1％琼脂糖凝胶电泳(130V，10min) 检测DNA质量；

(11)将合格样品放入-20℃保存备用。

2、混池PCR

结合系谱，选出70头血缘较远的公牛。按上述公牛冻精基因组DNA提取步骤提取DNA后，取等量的DNA对70头公牛进行DNA混池，随机混3个池(池1和池2 分别20头公牛，池3包括30头公牛)。利用已知牛PHRF1基因序列(GeneBank登录号：100126170)对外显子区及部分侧翼区进行引物设计，送由生工生物工程(上海) 股份有限公司完成进行合成(表2)。

表2 PHRF1基因引物信息

分别以三个DNA池为模板，进行PCR扩增，PCR体系和反应条件如表3和表4 所示：

表3 PCR反应体系

表4 PCR反应条件

3、候选基因PHRF1多态性筛查

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳(130V，20min)检验后，直接送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，共发现了7个SNPs(表5)。图2给出了公牛DNA混池测序中SNP3(位于PHRF1基因的cDNA序列的第2029位，因此命名为T2029C) 的峰图，箭头所示位置为突变位点。用于扩增SNP3位点的引物为表2中序列14的引物对，采用该引物对能够检测SNP3位点的基因型，该引物对具体如下：

上游引物PHRF1-Forward1：5’-AGGCCCTTTCTGATCCACGA-3’；

下游引物PHRF1-Reverse1：5’-GTGGGGTTGAAGGGGTCATAG-3’。

表5荷斯坦牛群PHRF1基因中的7个SNPs

SNP编号RS号基因内位置染色体位置(bp)碱基突变SNP1rs381020977外显子329:50,926,097G/CSNP2rs210076170外显子1129:50,913,253T/CSNP3rs210348413外显子1429:50,911,290T/CSNP4rs378829020外显子1529:50,908,772C/TSNP5rs1352096673’侧翼29:50,907,378C/TSNP6rs3844586913’侧翼29:50,907,175T/CSNP7rs3821183743’侧翼29:50,906,941T/G

注：SNPs信息来自Ensembl数据库(http://www.ensembl.org/index.html)，基因组版本为Bos taurus UMD3.1。

实施例3、SNPs大群分型及其与荷斯坦牛热应激下各生理指标和产奶性能EBVs 的关联分析

随机选择来自北京地区系谱清晰、表型以及DHI记录完整的1,665头荷斯坦泌乳牛作为试验群体，静脉采集10mL抗凝血，然后取800μL血液，选用血液基因组提取试剂盒(货号：DP318-03，天根生化科技(北京)有限公司)，按照说明书进行DNA提取。使用NanoDrop2000紫外分光光度计和1％琼脂糖凝胶电泳(130V，20min)检测 DNA提取质量，将检测合格的DNA存放在-20℃冰箱保存备用。

1、PHRF1基因SNPs大群分型方法的建立

采用竞争性等位基因特异性PCR法(KASP)获得每一个个体SNP基因型。根据每个位点左右的核酸序列设计竞争性等位基因特异性PCR引物，包括两条特异性引物 (Fam和Hex)和一条通用引物(Com)，所有引物在Lifetech公司合成(表6)。

表6竞争性等位基因特异性PCR引物

引物验证在Douglas Array Platformwan完成，反应条件完全按照其平台标准程序，在NEXAR液体处理工作站上加入DNA和PCR mix，在SOELLEX高通量 PCR水浴中完成PCR反应。其中，反应试剂中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等。荧光探针A的序列为5’ -GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，5’末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B 的序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列为5’-AGCATGAACTTGG TCACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B的序列为5’-AATCCGTTGACT CCGACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ。反应程序为：第一步，预变性，94℃，15min；第二步，富集含有SNP 位点的模板DNA，94℃，20S，61～55℃，60S，共10个循环，每个循环减低0.6℃；第三步，荧光信号放大，94℃，20S，55℃，60S，共26个循环。PCR反应结束后，通过ARAYA荧光阅读仪读取荧光信号，将结果导入数据库，使用Kraken^TM软件进行分型。图3给出采用竞争性等位基因特异性PCR法检测SNP3位点不同基因型的分布情况。图中红色为CC基因型个体，绿色为CT基因型个体，蓝色为TT基因型个体，紫色为分型无法明确的个体，黑色为空白对照。

待标记引物验证成功后，同样采用上述过程获得1,665头荷斯坦牛个体在PHRF1基因中7个SNP位点的基因型。

2、PHRF1基因SNPs与热应激下荷斯坦牛各生理指标EBVs的关联分析

为了验证PHRF1基因中7个SNP位点与荷斯坦牛热应激反应的关联性，本发明于2016年至2017年6-8月份在北京地区增加测定7,982头中国荷斯坦泌乳牛，除测定热应激状态下直肠温度外，还进行了热应激状态下呼吸评分及流涎指数的评定，测定时间为上午7:00-10:00和下午14:00-17:00(测定时间内，根据NY/T 2363-2013，当牛舍平均温湿度指数72≤THI≤79时，荷斯坦牛处于轻度热应激状态；当牛舍平均温湿度指数78＜THI≤88时，荷斯坦牛处于中度热应激状态；当牛舍平均温湿度指数＞ 88时，荷斯坦牛处于重度热应激状态)，其评定标准见表7和表8。采用多性状动物模型(同模型Ⅰ)，使用DMU(Version：6，Release：5.2)软件计算性状的估计育种值 (EBV)。计算过程中，利用平均信息约束估计最大似然法(AI-REML法)求解混合线性方程组(MME)获得性状的方差组分和协方差组分估值，并获得每个个体各性状的估计育种值(EBV)。采用SAS 9.13软件中的GLM过程对荷斯坦牛直肠温度EBV、呼吸评分EBV、流涎指数EBV与各SNPs不同基因型进行关联分析，分析结果见表9。

表7泌乳牛呼吸评分标准

表8泌乳牛流涎指数评分标准

流涎评分流涎情况口鼻情况1几乎无流涕和流涎鼻镜湿润，下巴干净2少量涎水流出，呈丝状悬挂或水状滴落下巴微湿，沾有少量饲草3涎水或鼻涕成股下流，甚至张口呼吸下巴沾湿，沾有大量饲草

表9 PHRF1基因SNPs与热应激下荷斯坦牛各生理指标EBVs的相关性

3、PHRF1基因SNPs与热应激下荷斯坦牛各产奶性能的关联分析

此外，为了进一步评估各位点是否与荷斯坦牛的产奶性能具有关联性，采用SAS9.13软件中的GLM过程对荷斯坦牛产奶量EBV、乳脂量EBV、乳脂率EBV、乳蛋白量EBV、乳蛋白率EBV、体细胞数EBV与各SNPs不同基因型进行关联分析，分析结果见表10。其中，各产奶性状EBVs来自北京奶牛中心。

表10 PHRF1基因SNPs与热应激下荷斯坦牛各产奶性能EBVs的相关性

4、荷斯坦牛热应激耐受能力分子标记的确定

综合考虑各SNPs与热应激下荷斯坦牛各生理指标与产奶性能EBVs关联分析的结果，我们筛选到PHRF1基因的SNP3可作为分子标记在荷斯坦牛热应激耐受能力育种中进行应用，并且不会影响产奶性能。其中，SNP3位点(位于PHRF1基因的cDNA 序列的第2029位，因此命名为T2029C)CC基因型个体具有较低的直肠温度、呼吸评分及流涎指数，较低的体细胞数，且不影响其产奶量、乳蛋白等产奶性能。因此可作为优势基因型对荷斯坦牛的耐热能力进行选择，为荷斯坦牛标记辅助选育耐热群体提供了一种更为有效、简单易操作、多态信息量高的分子遗传标记，为荷斯坦牛的耐热能力改良提供了一种有效的分子标记手段，为加快育种进程奠定了基础。

5、用于鉴定荷斯坦牛基因组中PHRF1基因SNP3位点基因型引物的确定

根据上述结果，可确定本发明用于鉴定荷斯坦牛基因组SNP3位点基因型的普通PCR和KASP引物，具体信息如下：

(1)普通PCR引物

上游引物PHRF1-Forward1：

5’-AGGCCCTTTCTGATCCACGA-3’(SEQ ID No.4)；

下游引物PHRF1-Reverse1：

5’-GTGGGGTTGAAGGGGTCATAG-3’(SEQ ID No.5)。

上述SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的扩增产物长度为1018bp，其中包括了844bp 的PHRF1基因外显子14，SNP3位点位于该扩增产物的471bp处。

(2)KASP引物

上游引物Fam Primer：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT>

上游引物Vic Primer：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT>

下游引物Com Primer：5’-GTCAGAACTGCTGTGTGAGGCCTT-3’(SEQ ID No.3)。

上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增荷斯坦牛基因组中PHRF1基因SNP3位点(T2029C)基因型为TT(即基因组中 PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体)的片段。

上述SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增荷斯坦牛基因组中PHRF1基因SNP3位点(T2029C)基因型为CC(即基因组中 PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体)的片段。

上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子、SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与 SEQID No.3所示的单链DNA分子扩增荷斯坦牛基因组中PHRF1基因SNP3位点 (T2029C)基因型为TC(即基因组中PHRF1基因的cDNA序列的第2029位脱氧核糖核苷酸是T和C的杂合体)的片段。

实施例4、T2029C位点不同基因型个体的外周血单个核细胞在不同热应激程度下PHRF1基因的差异表达

1、细胞培养及温度处理

(1)以PHRF1基因T2029C位点为CC基因型和TT基因型的荷斯坦牛为试验对象，采集尾静脉抗凝血，每头牛约30mL，按Ficoll淋巴细胞分离液(货号：17-1440-02，美国通用电气公司)的操作说明进行外周血单个核细胞(PBMC)的分离，最后用500 μL PBS重悬细胞，计数后以1×10⁵/孔的细胞密度进行12孔板铺板，于10％FBS的>2的细胞培养箱中培养。

(2)热应激选择39℃、42℃，分别代表轻度和重度热应激，37℃作为对照组，每组处理设置12个重复。细胞常规培养24h后，实验组分别在39℃、42℃的水浴中热应激处理1h，而对照组在37℃水浴培养相同时间。

2、细胞总RNA的提取

(1)取出热应激处理的细胞，吸取细胞至1.5mL离心管中，850g·min^-1离心5min>

(2)加氯仿200μL，剧烈震荡15s后室温静置5min，分层；

(3)4℃12000g·min^-1离心15min，管中液体分为三层：上清水相(RNA)、中间白膜层(DNA)、下层有机相(含有蛋白)；

(4)小心收集上清水相置于另一个1.5mL的离心管，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温静止10min；

(5)4℃12000g·min^-1离心10min，可见白色RNA沉淀；

(6)弃上清，加1mL预冷的75％的乙醇(1％DEPC水配制)，轻弹管壁，使沉淀悬浮；

(7)4℃7500g·min^-1离心5min，沉淀即为总RNA；

(8)弃上清，将残留乙醇用移液枪吸干净，空气中干燥5～10min，加20μL RNase-free的水充分溶解，-80℃保存。

(9)取3μL RNA样品，1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；

(10)取1μL RNA样品，使用Nanodrop2000检测RNA的浓度(ng/μL)及纯度 (OD 260/280)。

3、RNA反转录为cDNA

采用Takara cDNA第一链合成试剂盒(货号：D6130，宝日医生物技术(北京)有限公司)将RNA反转录为cDNA，按操作说明书去除基因组DNA(gDNA)后建立20μL 的反转录体系，并进行反应(表11、表12和表13)。

表11 gDNA去除反应体系

组成成分使用量(μL)5×gDNA Buffer2Total RNA1000/RNA浓度RNase-Free ddH₂O补足到终体积为10μL

表12反转录反应体系

试剂使用量(μL)gDNA去除反应液1010×Fast RT Buffer2RT Enzyme Mix1FQ-RT Primer Mix2RNase-Free ddH₂O5

表13反应条件

4、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)在线程序primer-blast设计PHRF1 基因以及GAPDH基因的RT-qPCR引物，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息见表14。

表14 RT-qPCR引物序列

使用SuperReal PreMix Plus定量试剂盒(货号：FP205，天根生化科技(北京)有限公司)，按操作说明书获得目的基因和内参基因的Ct值，RT-qPCR反应体系和反应条件见表15和表16，最后以GAPDH作为内参基因，通过比较Ct法(2^-ΔCT)计算目的基因mRNA的相对表达量，每个试验独立重复三次，结果用Mean±SD表示。

表15 RT-qPCR反应体系

组成成分使用量(μL)2×SuperReal PreMix Plus10Primer-Forward(10μM)0.6Primer-Reverse(10μM)0.6cDNA模板(10ng/μL)2.0RNase-Free H2O6.8

表16 RT-qPCR反应条件

结果显示：CC基因型和TT基因型个体的PBMC经过热处理后，随着温度的升高PHRF1基因表达量均呈上升趋势，其中二者PBMC中PHRF1基因的表达量在37℃ (对照组)条件下无显著差异；二者PBMC中PHRF1基因的表达量在39℃(轻度热应激组)下有极显著差异(P<0.01)，且TT基因型个体中PHRF1基因的表达量高于 CC基因型个体；二者PBMC中PHRF1基因的表达量在42℃条件下(重度热应激组) 无差异(P>0.05)。图4给出T2029C位点不同基因型个体的PBMC在不同程度热应激下PHRF1基因mRNA的表达情况。a图为CC基因型个体PBMC在不同程度热应激后PHRF1基因mRNA表达的比较；b图为TT基因型个体PBMC在不同程度热应激后PHRF1基因mRNA表达的比较；c图为CC和TT基因型个体PBMC在不同程度热应激后PHRF1基因mRNA表达的比较。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

<110> 中国农业大学

<120> 荷斯坦牛热应激耐受能力的分子标记及检测方法

<130> GNCLN190869

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tcactctctg cctcttgggc ct 42

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tactctctgc ctcttgggcc c 41

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

gtcagaactg ctgtgtgagg cctt 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

aggccctttc tgatccacga 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

gtggggttga aggggtcata g 21