用于鹦鹉热衣原体基因型检测的引物和探针组合及应用

摘要

本发明提供用于鹦鹉热衣原体基因型检测的引物和探针组合及应用。本发明依据鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,C.psittaci)血清型与其ompA基因型之间的对应性和等价性，通过分析与筛选鹦鹉热衣原体ompA基因VD1～VD4区基因序列，设计出C.psittaci基因型特异性探针及引物。本发明还提供基于所述探针制作的ompA基因特异区的基因型鉴定芯片。本发明提供一种新的可快速、有效且高通量检测C.psittaci基因型的微阵列芯片方法，敏感性、特异性好，为鹦鹉热衣原体基因型诊断、分析和研究提供新的切实有效的检测方法，为鹦鹉热衣原体的诊断、流行病学调查和传染病防控提供有效手段。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及用于鹦鹉热衣原体基因型检测的引物和探针组合及应用。

背景技术

鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,C.psittaci)是一种严格真核细胞内寄生的人畜共患病病原体，最先从鹦鹉体内被分离出来，作为一种自然疫源性病原体，其宿主范围极其广泛，可以引起人类、家禽、野生禽类、家畜的感染及引发多种疾病。C.psittaci的传播主要发生于鸟类与家禽，引起禽类严重的呼吸道疾病、消化道疾病和生产性能的降低，由于其部分感染状态呈隐性感染,对禽类养殖业会造成长期性危害和损失。当人类与感染C.psittaci的动物接触时，主要经呼吸道吸入病禽粪便、分泌物、患病动物呼吸道排出的有感染性的气溶胶，或者病原体经眼结膜、黏膜侵入人体，从而引起人类呼吸道感染，表现为非典型肺炎，以及菌血症，临床上称之为鹦鹉热(psittacosis)或鸟疫(ornithosis)。20世纪50年代以来，世界各地曾报道过几起源于家禽和火鸡的人群鹦鹉热的爆发。如今，随着人类大规模集约化饲养家禽以来，鸡、鸭、鸽子和火鸡等家禽便成为人类感染C.psittaci的重要传染源，密集化养殖场高浓度的病原体污染环境下，对养殖人员健康的威胁愈发突出。C.psittaci还可以感染多种哺乳动物和家畜，导致牛、羊、猪等动物肺炎、肠炎，泌尿生殖道炎症以及怀孕动物流产、早产、产弱胎或死胎。

C.psittaci对不同宿主的侵袭力与致病力不同，主要依赖于其不同的血清型，目前将C.psittaci分为A,B,C,D,E,E/B,F,WC和M56共9种血清型，各血清型具有一定的宿主特异性，A型主要宿主为鹦鹉、鸽子和人；B型主要宿主为鸽子，火鸡，牛；C型主要宿主为鸭子，鹅，火鸡，松鸡以及人类；D型主要宿主为火鸡，鹦鹉，鸽子，对人的感染力较强；E型的宿主范围最广泛，包括鸽子，鸭子，火鸡(低毒性)，E型也曾从人类肺炎病例中分离得到；F型对鹦鹉的特异性很强；E/B型是近年来新鉴定的血清型，鸭子为主要感染宿主；WC型和M56型主要在野生禽类和家畜间传播。以上可以看出C.psittaci的A型,C型,D型和E型都可在人群间传播以及导致人的感染和发病，作为人畜共患传染病病原，不仅对畜牧业生产造成巨大威胁与损失，也严重威胁人类健康。因此C.psittaci血清型的检测对该病原的检测和流行情况的监控，人类公共卫生防控具有重要意义。

目前对C.psittaci分型的诊断方法主要有:(1)利用血清型特异性单克隆抗体进行C.psittaci血清型分型。该方法缺少现成的成套商业化血清型检测单抗，待测衣原体菌株需要进行细胞培养和专业纯化，需要专业的衣原体培养技术和相应培养条件，并且针对非典型的分离株，该方法的诊断受到限制。(2)PCR-RFLP,对ompA基因进行限制性片段长度多态性分析。该方法在临床样本的敏感性有所限制，若达到较好的敏感性，仍然需要样本进行细胞培养。针对非典型分离株，该方法的诊断受到限制。(3)ompA基因测序鉴定。该方法虽最精确，但是由于费用和效率较低等因素，在临床实际大量检测样本时并不作为实际检测手段。因而当前仍然没有一种实际且有效的检测方法能解决C.psittaci基因分型的检测。

目前，无论基于PCR-RFLP法还是荧光定量PCR法，在国内市场尚无成熟的鹦鹉热衣原体基因型诊断的试剂盒，同时在该人畜共患病病原—C.psittaci的基因型诊断方面的研究较少，目前为止也没有利用基因芯片法进行高通量、高效率检测和分析C.psittaci各基因型的成熟方案。本发明以既能用于实验室菌株分型研究又能用于临床快速高效检测为目的，开发鹦鹉热衣原体基因型特异性诊断基因芯片，为C.psittaci基因型诊断提供新的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供用于鹦鹉热衣原体基因型检测的引物和探针组合及应用。

本发明的另一目的是提供基于ompA基因特异区的基因型(血清型)鉴定诊断基因芯片。

本发明构思如下：根据C.psittaci基因序列分析结果，各血清型之间的核苷酸差异主要发生于ompA基因的4个变异区(VD1～VD4)。研究发现鹦鹉热衣原体血清型与ompA基因型具有对应性和等价性，基于该生物信息特点，将ompA基因作为C.psittaci血清型分型的精确靶基因。

为了实现本发明目的，本发明依据鹦鹉热衣原体(C.psittaci)血清型与其ompA基因型之间的对应性和等价性，通过分析与筛选鹦鹉热衣原体ompA基因VD1～VD4区基因序列，设计并获得C.psittaci基因型特异性探针和特异性引物。对特异性引物进行5’Biotin修饰，在芯片杂交反应中引入链酶亲和素-辣根过氧化物酶(SA-HRP)，显色过程中加入可沉淀型的TMB底物，从而达到HRP酶催化下形成沉淀型显色斑点，达到可视化检测C.psittaci，并鉴定其基因型的一种新型的寡核苷酸探针基因芯片检测法，实现高通量检测及可视化判读鹦鹉热衣原体不同基因型。

第一方面，本发明提供用于鹦鹉热衣原体基因型检测的引物，包括2对引物，引物对1和引物对2，序列分别如SEQ ID NO:1-2所示和SEQ ID NO:3-4所示。SEQ ID NO:3所示的序列，N代表次黄嘌呤碱基I；W代表A或T；M代表A或C，Y代表C或T，R代表A或G。

第二方面，本发明提供用于鹦鹉热衣原体基因型检测的探针组合，所述探针组合包括：

鹦鹉热衣原体A基因型特异性探针，序列分别如SEQ ID NO:5-6所示；

鹦鹉热衣原体B基因型特异性探针，序列如SEQ ID NO:7所示；

鹦鹉热衣原体C基因型特异性探针，序列分别如SEQ ID NO:8-9所示；

鹦鹉热衣原体D基因型特异性探针，序列分别如SEQ ID NO:10-11所示；

鹦鹉热衣原体E基因型特异性探针，序列分别如SEQ ID NO:12-13所示；

鹦鹉热衣原体E/B基因型特异性探针，序列如SEQ ID NO:14所示；

鹦鹉热衣原体F基因型特异性探针，序列分别如SEQ ID NO:15-17所示；

鹦鹉热衣原体WC基因型特异性探针，序列分别如SEQ ID NO:18-19所示；

鹦鹉热衣原体M56基因型特异性探针，序列如SEQ ID NO:20所示。

第三方面，本发明提供用于鹦鹉热衣原体基因型检测的引物和探针组合，包含SEQID NO:1-4所示的引物以及SEQ ID NO:5-20所示的探针组合。

第四方面，本发明提供用于鹦鹉热衣原体基因型检测的芯片，即基于ompA基因特异区的基因型(血清型)鉴定诊断基因芯片。

所述芯片包括芯片载体和SEQ ID NO:5-20所示的特异性探针。

优选地，所述芯片还包括2条阳性对照探针，序列分别如SEQ ID NO:21-22所示；1条质控探针，序列如SEQ ID NO:23所示；以及对照探针，所述对照探针为点样稀释液。SEQID NO:22所示的序列，N代表次黄嘌呤碱基I；W代表A或T；M代表A或C，Y代表C或T，R代表A或G。

在本发明的一个具体实施方式中，基因芯片的制备如下：

将设计好的各基因型特异性探针序列交由上海生工生物有限公司合成，探针无需额外修饰和添加摆动臂，用双蒸水稀释各探针至100ng/μL作为储存浓度，点样时再用双蒸水稀释各储存浓度探针至10ng/μL，作为工作浓度。用市售基因芯片点样仪在方形尼龙膜上点样(芯片阵列如图1所示)，之后将芯片放入紫外仪，探针面朝上，进行紫外交联反应10-15min，之后避光2h，目的是使探针与载体充分交联以连接牢固，完成后4℃保存芯片待用。经过不同探针浓度梯度验证，最终得到探针的最佳稀释浓度为6ng/μL。

第五方面，本发明提供含有SEQ ID NO:1-4所示的引物，SEQ ID NO:5-20所示的特异性探针，所述引物和探针组合，或所述基因芯片的试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括阳性质粒模板，所述阳性质粒模板为分别携带A、B、C、D、E、E/B、F、WC、M56各基因型对应的ompA基因片段的载体。

更优选地，克隆载体为pMD18-T。

在本发明的一个具体实施方式中，为确保本发明所述芯片检测的准确性，所述试剂盒包括一套与所述芯片配套使用的质粒标准参比品。所述质粒标准参比品由分别含有鹦鹉热衣原体A基因型的标准菌株VS1，B基因型的标准菌株CP3，C基因型标准菌株GR9，D基因型标准菌株NJ1，E基因型标准菌株CPMN，E/B基因型标准菌株WS/TR/E30，F基因型标准菌株VS225，WC基因型标准菌株WC和M56基因型标准菌株M56的ompA基因的重组质粒组成。所述重组质粒由pMD18-T质粒制备。具体地，所述质粒标准参比品包括以下9种质粒标准品：

鹦鹉热衣原体A基因型:pGM-T-VS1ompA质粒标准品；

鹦鹉热衣原体B基因型:pGM-T-CP3ompA质粒标准品；

鹦鹉热衣原体C基因型:pGM-T-GR9ompA质粒标准品；

鹦鹉热衣原体D基因型:pGM-T-NJ1ompA质粒标准品；

鹦鹉热衣原体E基因型:pGM-T-CPMN ompA质粒标准品；

鹦鹉热衣原体EB基因型:pGM-T-WS/TR/E30ompA质粒标准品；

鹦鹉热衣原体F基因型:pGM-T-VS225ompA质粒标准品；

鹦鹉热衣原体WC基因型:pGM-T-WC ompA质粒标准品；

鹦鹉热衣原体M56基因型:pGM-T-M56ompA质粒标准品。

本发明提供的芯片不仅能够检测并判断待测菌株是否为鹦鹉热衣原体，如果是鹦鹉热阳性菌株，可以直接鉴定出其基因型，该芯片的基因型特异性检测探针包含了C.psittaci种下所有9种基因型：鹦鹉热衣原体A基因型，B基因型，C基因型，D基因型，E基因型，E/B基因型，F基因型，WC基因型和M56基因型。

第六方面，本发明提供SEQ ID NO:1-4所示的引物，SEQ ID NO:5-20所示的特异性探针，所述引物和探针组合，所述基因芯片或者所述试剂盒的以下任一应用：

1)用于非诊断目的的鹦鹉热衣原体基因型检测；

2)用于鹦鹉热血清型鉴定。

进一步地，所述应用包括以下步骤：

1)提取样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增反应；

3)将PCR扩增产物与所述特异性探针进行杂交，并通过向杂交反应中引入链酶亲和素-辣根过氧化物酶系统，在显色过程中加入TMB底物，实现可视化检测。

优选地，本发明所述引物的5′端由Biotin修饰。

具体地，步骤1)应用商品化的细菌基因组提取试剂盒提取待测病原菌的核酸样本。

步骤2)利用第一对引物(C.psitt_omp_f1和C.psitt_omp_r1)和第二对引物(C.psitt_omp_f2和C.psitt_omp_r2)的双重PCR反应体系同时扩增并获得芯片的靶序列，提高芯片检测的效率。扩增出芯片探针的靶序列—ompA基因的VD1-VD2和VD3-VD4两段目的序列区。优选地，引物终浓度为0.5μM。用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，目的条带分别为418bp和570bp。

优选地，PCR扩增条件为：96℃预变性1min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；共40个循环；72℃延伸4min；4℃保存。

步骤3)芯片杂交与显色：

本发明所述基因芯片试剂盒，包含芯片反应过程中配套使用的各工作液，包含：杂交液A、洗涤液B、洗涤液C、结合液D、显色液(W4液)。

用M1、M2和M3液(表1)配制芯片工作液：杂交液A、洗涤液B和洗涤液C(基因芯片配套试剂M1，M2，M3,W4，购自上海界源生物技术有限公司)。基因芯片配套试剂中的W4液为芯片显色反应过程中使用的沉淀型TMB显色液。

表1

(1)变性与杂交过程：PCR产物：杂交液(A液)＝50μL:1mL体积比配置混匀后，放入金属浴96℃，变性4min后，放入冰盒冷却2min，之后将基因芯片放入杂交盒内，将杂交液加于芯片阵列表面，60℃，1h进行杂交反应；

(2)基因芯片的显色及结果判读

1)洗涤1:杂交完成后，弃掉杂交盒中的杂交液，用47℃预热好的洗涤液(B液)淋洗一遍，再用47℃预热好的洗涤液(B液)洗涤10min，重复两遍；

2)结合HRP:配置结合液：链酶亲和素－辣根过氧化物酶(SA-HRP)：A液＝1μL：2000μL的体积比配制2mL结合液D，结合液D加入到基因芯片杂交盒中，与芯片室温孵育15min；

3)洗涤2:弃结合液D后取出基因芯片用杂交液A室温淋洗芯片两次，洗涤液C室温淋洗两次；

4)显色：在芯片表面加400μL W4液(沉淀型TMB显色液)，室温孵育2-4min后去掉显色液，TMB在HRP的催化下形成蓝色沉淀颗粒，即显色质控位点、阳性对照位点以及被捕获的靶基因位点呈现蓝色斑点，芯片背景呈现白色。该TMB蓝色沉淀型芯片显色系统的优点是背景值低、显色明显、不需要额外的扫描仪，可直接肉眼观察，根据基因芯片的阵列以及阴阳性对照，即可清晰地判读被测菌株的基因型。

根据上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明依据C.psittaci各基因型在ompA基因上的多样性和规律性，结合基因芯片的原理和优势以及TMB沉淀型可视化显色系统的优势，通过分析筛选C.psittaci ompA基因序列，获得高保守片段以及基因型间高变异片段，获得引物和基因型特异性探针，建立一种可视化显色的寡核苷酸探针基因芯片，实现检测和直接判读鹦鹉热衣原体基因型的目的。该芯片的检测有准确、快速、高特异和高敏感性等优点，解决了依赖血清型特异性单克隆抗体分型法、PCR-RFLP分型法和基因测序法的繁琐、局限、低效率，在实际检测中无法有效广泛应用等问题。该C.psittaci基因型特异性检测芯片适宜在中小型医疗机构、临床现场中应用检测，对指导临床治疗，鹦鹉热衣原体的防控防治，以及衣原体流行病学调查具有重要意义。本发明提供的高通量、可视化、高效率C.psittaci基因型检测基因芯片无论是实验室研究还是临床检测，均可实现有效的基因分型。

附图说明

图1为本发明实施例1中鹦鹉热衣原体基因型特异性基因芯片的点样矩阵示意图。

图2为本发明实施例1中待测基因样品用特异性引物(C.psitt_omp_f1和C.psitt_omp_r1；C.psitt_omp_f2和C.psitt_omp_r2)进行双重PCR扩增后所得产物的电泳条带图。其中：M:2000bp Maker；1:鹦鹉热衣原体6BC株(基因型A)；2:鹦鹉热衣原体基因型F质粒；3:沙眼衣原体；4:肺炎衣原体；5:流产衣原体；6:鹦鹉热衣原体CP3株(基因型B)；7:大肠杆菌；8:沙门氏菌。

图3为本发明实施例2中9种鹦鹉热衣原体基因型的各质粒标准品验证基因芯片特异性的实验图谱。

图4为本发明实施例3中细胞培养菌株(A)和临床阳性病料(B)进行鹦鹉热衣原体基因型特异性检测基因芯片检验的检测图。

图5为本发明实施例4中基因芯片特异性检测结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1鹦鹉热衣原体基因型特异性探针和引物的筛选

1、材料

衣原体探针和引物：委托生工生物工程(上海)股份公司进行合成。

基因芯片点样仪，PersonalArrayer^TM16个人点样仪：由北京博奥晶典生物技术有限公司提供。

细菌核酸的提取试剂盒：全式金(北京)生物技术有限公司提取试剂盒(EasyPureBacteria Genomic DNA Kit，货号：EE161-01)。

尼龙膜(Nylon Membranes,positively charged,Roche公司)：购自Sigma-Aldrich公司。

辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin-HRP)：购自Thermo FisherScientific公司。

基因芯片配套试剂(M1，M2，M3,W4)，购自上海界源生物技术有限公司。根据配比说明书(表1)配置芯片工作液：杂交液A、洗涤液B和洗涤液C。基因芯片配套试剂中的W4液为芯片显色过程中使用的沉淀型TMB显色液。

2、方法

鹦鹉热衣原体基因型特异性引物和探针的筛选过程如下：

在NCBI网站的GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上检索并下载鹦鹉热衣原体所有菌株的ompA基因组，共包括69个菌株的基因组(表2)。

表2鹦鹉热衣原体菌株名称

应用MegAlign软件对上述C.psittaci所有69个菌株基因组的ompA基因进行比对和筛选：根据ompA基因的特点，将ompA基因进行分区段分析，分别比对所有鹦鹉热依原体ompA基因的VD1、VD2、VD3、VD4区以及VD区之间的五段保守区。

其中，针对VD1、VD2、VD3、VD4区的筛选，旨在寻找“最高变区”。经过一系列比对后，初步筛选出一批鹦鹉热衣原体基因型特异初筛探针，共36条。将所有这些初筛探针点制成基因芯片，通过实际标准基因组样本检测，以分析、验证和评价每一条初筛探针的效率。利用鹦鹉热衣原体所有基因型菌株的各标准基因组和标准质粒，检测这些初筛探针的有效性，剔除非特异性杂交、低效率杂交、低敏感性的探针，旨在最终获得实际可用的最高效的C.psittaci基因型特异性探针。经过大量的实际标准基因组样本验证分析，最终发现位于ompA基因VD1-VD2区的高变区和VD3-VD4区的高变区，这两个C.psittaci高变区(VD1-VD2区和VD3-VD4区)的特点在于核苷酸碱基位点的变异呈现针对基因型典型的规律性，即基因型间差异较大，而基因型内保守度较好，且相对应的探针已经在实际检测验证中反应效率很好，具有高特异性和敏感性。因此将这两段序列作为基因型特异性探针的筛选区域，最终获得一套最优化的鹦鹉热衣原体基因型特异性探针，所述探针的序列见SEQ ID NO:5-20(表4)。

由此，分别对这两段“最高变区”序列上、下游的ompA基因保守区进行筛选比对，得到两对通用引物，第一对引物：C.psitt_omp_f1和C.psitt_omp_r1，引物目的片段大小为418bp，所述引物的序列为：SEQ ID NO:1-2；第二对引物：C.psitt_omp_f2和C.psitt_omp_r2，引物目的片段的大小为570bp；所述引物的序列为：SEQ ID NO:3-4(表3)。

同时设计该基因芯片的显色质控探针兼定位探针、阳性对照探针和阴性对照探针：与C.psitt_omp_f1和C.psitt_omp_f2引物互补的序列作为阳性对照探针，以杂交液作为阴性对照探针，显色质控探针兼定位探针是20T序列，并在5’端连接生物素(Biotin)。所述显色质控探针兼定位探针。

表3鹦鹉热衣原体特异性扩增引物

表4鹦鹉热衣原体基因型特异性寡核苷酸探针序列

以上序列中所涉及的简并碱基的信息如下：简并碱基N代表次黄嘌呤核苷酸I；简并碱基W代表核苷酸：A,T；简并碱基代表M代表核苷酸A,C；简并碱基Y代表核苷酸C,T；简并碱基R代表核苷酸A,G。

实施例2鹦鹉热衣原体基因型特异性基因芯片的制备

本实施例通过由实施例1中所述最终获得的最优引物和探针制备芯片，并对芯片杂交条件和显色条件进行优化，最终优选出制作芯片的最佳反应体系，保证本芯片的检测结果达到最优。

1、材料

衣原体探针和引物：委托生工生物工程(上海)股份公司进行合成。

基因芯片点样仪，PersonalArrayerTM16个人点样仪：由北京博奥晶典生物技术有限公司提供。

细菌核酸的提取试剂盒：全式金(北京)生物技术有限公司提取试剂盒(EasyPureBacteria Genomic DNA Kit，货号：EE161-01)。

尼龙膜(Nylon Membranes,positively charged,Roche公司)：购自Sigma-Aldrich 公司。

辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin-HRP)：购自Thermo FisherScientific公司。

基因芯片配套试剂(M1，M2，M3,W4)，购自上海界源生物技术有限公司。根据配比说明书(表1)配置芯片工作液：杂交液A、洗涤液B和洗涤液C。基因芯片配套试剂中的W4液为芯片显色过程中使用的沉淀型TMB显色液。

2、方法

2.1鹦鹉热衣原体基因型特异性基因芯片的制备过程以及探针阵列

将最终确定的探针和引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，探针无需添加摆动臂以及特殊修饰，参照表3在每条引物的5’进行Biotin修饰。合成的引物和探针干粉置于-20℃冰箱储存备用。将装有探针(干粉)的离心管置于离心机内，以12000rpm离心5min，加入双蒸水稀释各探针至浓度为100ng/μL作为储存浓度，点样时用双蒸水稀释探针至10ng/μL作为工作浓度。

确定最终的探针阵列，为5×5阵列，探针阵列见图1。阵列图中各字母代表的探针如下：

A1C.psittaci A基因型探针SEQ ID NO:5F2C.psittaci F基因型探针SEQ ID NO:16A2C.psittaci A基因型探针SEQ ID NO:6F3C.psittaci F基因型探针SEQ ID NO:17BC.psittaci B基因型探针SEQ ID NO:7WC1C.psittaci WC基因型探针SEQ ID NO:18C1C.psittaci C基因型探针SEQ ID NO:8WC2C.psittaci WC基因型探针SEQ ID NO:19C2C.psittaci C基因型探针SEQ ID NO:9M56C.psittaci M56基因型探针SEQ ID NO:20D1C.psittaci D基因型探针SEQ ID NO:10PC1阳性对照探针SEQ ID NO:21D2C.psittaci D基因型探针SEQ ID NO:11PC2阳性对照探针SEQ ID NO:22E1C.psittaci E基因型探针SEQ ID NO:12SC显色质控探针SEQ ID NO:23E2C.psittaci E基因型探针SEQ ID NO:13NC阴性探针杂交液E/BC.psittaci E/B基因型探针SEQ ID NO:14F1C.psittaci F基因型探针SEQ ID NO:15

按照图1所述的探针阵列，用市售的基因芯片点样仪(北京博奥晶典生物技术有限公司)按已设定好的程序以接触式或喷射式形式在方形尼龙膜上点样；或者在没有点样仪的情况下，可以手工制备基因芯片：用10μL的移液枪，调至0.2μL后吸取相应稀释好的探针，在方形尼龙膜上点样(点样阵列如图1所示)。芯片点制完成后放入紫外仪，交联反应10min后避光2h，使探针与载体充分交联，之后保存备用。

2.2双重PCR反应特异性扩增

病原菌核酸的提取使用全式金(北京)生物技术有限公司的细菌基因组快速提取试剂盒(EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit，货号：EE161-01)进行病原菌核酸的提取，操作按说明书要求进行。

利用第一对引物(C.psitt_omp_f1和C.psitt_omp_r1)和第二对引物(C.psitt_omp_f2和C.psitt_omp_r2)的双重PCR反应体系(表5)提高芯片检测的效率，扩增出芯片探针的靶序列—ompA基因的VD1-VD2和VD3-VD4两段目的序列区。所优选的引物终浓度为0.5μM。用琼脂糖凝胶电泳对双重PCR产物进行检测，目的条带分别为418bp和570bp。

合成的引物干粉置于离心机内，以12000rpm离心5min，加入双蒸水稀释至浓度为100μM作为储存浓度，PCR时取10μL用双蒸水稀释至10μM作为工作浓度。

表5双重PCR体系

组分体积终浓度模板2.0μLC.psitt_omp_f11μL0.5μMC.psitt_omp_r11μL0.5μMC.psitt_omp_f21μL0.5μMC.psitt_omp_r21μL0.5μMPCR SuperMix25μLddH₂O19μL总体积50μL

PCR扩增反应条件为：96℃预变性1min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；共40个循环；72℃延伸4min；4℃保存。

反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，目的条带大小为417bp和570bp。图2为选取的衣原体菌株基因样品经PCR扩增后产物的电泳图。4℃保存PCR产物或进行下一步实验。

2.3基因芯片杂交与显色方案

2.3.1建立芯片杂交体系

(1)变性与杂交：PCR产物：杂交液(A液)＝50μL:1mL体积比配置混匀后，放入金属浴96℃，变性4min后，放入冰盒冷却2min，之后将基因芯片放入杂交盒内，将杂交液加于芯片阵列表面，60℃，1h进行杂交反应；

(2)基因芯片的显色及结果判读

1)洗涤1:杂交完成后，弃掉杂交盒中的杂交液，用47℃预热好的洗涤液(B液)淋洗一遍，再用47℃预热好的洗涤液(B液)洗涤10min，重复两遍；

2)结合HRP:配制结合液：链酶亲和素-辣根过氧化物酶(SA-HRP)：A液＝1μL：2000μL的体积比配制2mL结合液D加入到基因芯片杂交盒中，与芯片室温孵育15min；

3)洗涤2:弃结合液D后取出基因芯片用杂交液A室温淋洗芯片两次，洗涤液C室温淋洗两次；

4)显色：在芯片表面加400μL W4液(沉淀型TMB显色液)，室温孵育2-4min后去掉显色液，TMB在HRP的催化下形成蓝色沉淀颗粒，即显色质控位点、阳性对照位点以及被捕获的靶基因位点呈现蓝色斑点，芯片背景呈现白色。该TMB蓝色沉淀型芯片显色系统的优点是背景值低、显色明显、不需要额外的扫描仪，可以直接肉眼清晰地观察，根据基因芯片的阵列以及阴阳性对照，即可直接判读被测菌株的基因型。

2.3.2杂交反应体系的最优化

使用最优化的杂交反应条件可以确保和提高本发明基因芯片的特异性及灵敏度，本发明优化了以下条件：探针点样浓度、杂交反应液配比比例、杂交反应温度与时间、洗涤条件、结合液孵育温度与时间、显色反应时间等多个参数进行探索，最优条件的摸索和筛选如表6所示。

表6基因芯片杂交反应的条件优化参数

最终优选出的本芯片的最佳反应体系为：探针最佳点样浓度为6ng/μL，杂交过程中反应液最优配比比例为50μL:1mL，杂交反应的最优温度为55℃、最优时间为60min，洗涤条件为水浴37℃，3次，之后结合液孵育最优时间和温度为水浴37℃、20min，最终最佳显色条件为室温避光2-4min。在一系列最优化体系条件下进行芯片反应，本芯片的检测结果达到最优，芯片特异性、重复性、稳定性均良好。

实施例3鹦鹉热衣原体质粒标准参比品的构建

本实施例建立了一套该基因芯片的配套质粒标准参比品，从而减少从衣原体病原纯化标准基因组机会，降低感染几率，更方便的验证和检测基因芯片的效率；同时也作为衣原体种特异性芯片检测试剂盒相配套的标准参比品，在临床检样过程中建立阳性对照。

1、材料：

各基因型标准菌株：

基因型标准菌株AVS1BCP3CGR9DNJ1ECPMNFVS225E/BWS/TR/E30M56M56WCWC

本实验室保藏有鹦鹉热衣原体A、B、C和D基因型标准株或基因组。

细菌基因组DNA提取试剂盒：北京全式金生物技术有限公司的EasyPure BacteriaGenomic DNA Kit，货号：EE161-01。

质粒DNA可视化提取试剂盒：Plasmid MiniPrep Kit，货号：EM101-01。

pEASY-T1Cloning Kit试剂盒：北京全式金生物技术有限公司，货号：CT101-01,本快速克隆试剂盒中包含的克隆载体为pMD18-T载体。

微量分光光度计：Nano-300型，杭州奥盛仪器有限公司。2、方法：

2.1提取基因组：将以上拥有菌株分别培养纯化以后，进行提取基因组，用针对鹦鹉热衣原体ompA基因的特异性引物做PCR靶序列扩增，PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖凝胶回收试剂盒回收和纯化PCR产物，并提交与生工生物工程(上海)股份有限公司测序比对，以达到双重验证。

其余E、F、E/B、M56和WC基因型均未获得标准菌株或基因组，为满足实验需求，本发明由上海生工生物有限公司根据NCBI网站GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上已经公开的鹦鹉热衣原体CPMN株(E基因型)、鹦鹉热衣原体VS225株(F基因型)、鹦鹉热衣原体WS/TR/E30株(E/B基因型)、鹦鹉热衣原体M56株(M56基因型)和鹦鹉热衣原体WC株(WC基因型)的ompA基因脱氧核苷酸序列合成以上所述五个C.psittaci基因型的标准菌株的ompA序列样品，并按一定浓度稀释后储存备用。

2.2克隆质粒的构建和制备：应用pEASY-T1Cloning Kit试剂盒进行克隆载体的构建。

克隆反应体系如表7所示：

表7克隆反应体系

成分体积PCR Product0.5-4μLpEASY-T1 Cloning Vector1μL

离心管中加好试剂后轻轻混合后，室温(20℃-37℃)反应5分钟。反应结束后，至于冰上。

加连接产物于50μL Trans1-T1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴20-30分钟；42℃水浴热激30秒，立即至于冰上2分钟；取250μL至LB培养基，200rpm、37℃培养1小时；取200μL菌液均匀的涂在含有IPTG和X-gal的平板上，进行筛选培养。

2.3阳性克隆质粒的检测与质粒DNA的提取

通过PCR方法、限制性酶切分析以及测序三种方法对阳性克隆质粒进行检测和验证。对测序含目标片段的单克隆菌液使用质粒小提试剂盒提取质粒DNA，用微量分光光度计测定所提质粒的浓度，根据公式计算出拷贝数，无DNA酶水稀释成梯度：1×10⁶copies/μL、1×10⁵copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL、1×10²copies/μL、1×10¹copies/μL，分装后-20℃储存备用。

4、最终成功构建获得9种鹦鹉热衣原体各基因型标准株的质粒标准参比品如下：

鹦鹉热衣原体A基因型:pGM-T-VS1ompA质粒标准品；

鹦鹉热衣原体B基因型:pGM-T-CP3ompA质粒标准品；

鹦鹉热衣原体C基因型:pGM-T-GR9ompA质粒标准品；

鹦鹉热衣原体D基因型:pGM-T-NJ1ompA质粒标准品；

鹦鹉热衣原体E基因型:pGM-T-CPMN ompA质粒标准品；

鹦鹉热衣原体EB基因型:pGM-T-WS/TR/E30ompA质粒标准品；

鹦鹉热衣原体F基因型:pGM-T-VS225ompA质粒标准品；

鹦鹉热衣原体WC基因型:pGM-T-WC ompA质粒标准品；

鹦鹉热衣原体M56基因型:pGM-T-M56ompA质粒标准品。

经过多重验证，所构建的质粒标准品准确无误，图3为12种衣原体种的质粒标准品验证本基因芯片的实验结果图。

本发明构建的质粒标准品在芯片检测中效果良好，各种之间特异性达标，可以作为芯片验证和检样的标准依据，以及作为特异性和灵敏度检测的参考品。

实施例4鹦鹉热衣原体种特异性检测的芯片的样本检测以及符合性评价

本实施例用于使用本发明所提供的芯片，检测细胞培养菌株标本、临床所采的咽喉拭子、泄殖腔拭子、肺泡灌洗液、胎盘膜、阴道分泌物中的鹦鹉热衣原体病原以及对鹦鹉热衣原体基因型进行鉴别。

1、材料：

细菌基因组DNA提取试剂盒：全式金生物技术(北京)有限公司EasyPure BacteriaGenomic DNA Kit，货号：EE161-01。

基因芯片：实施例1制备的试剂盒。

参比组：衣原体ompA基因测序(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

样本来源：

(1)标准基因组来源：15份细胞培养菌株培养皿(包含鹦鹉热衣原体：6BC株、CP3株、NJ1株、GR9株；沙眼衣原体：D/UW-3/CX株；肺炎衣原体：N16株；流产衣原体：B577株；鼠衣原体：Mopn株以及阴性纯细胞培养物)。

(2)临床样本：咽喉拭子、泄殖腔拭子、肺泡灌洗液、胎膜、阴道分泌物样本。

2、方法：

基因组纯化：细胞培养菌株标本、咽喉拭子、泄殖腔拭子、肺泡灌洗液、胎膜、阴道分泌物样本，经过适当灭菌生理盐水稀释后，可以直接用试剂盒提取核酸样品；完成核酸准备后，可以按照如实施示例1.中所述，利用本发明的衣原体种属特异性基因芯片进行待测基因样品的检测和衣原体种属性鉴别。

随机选取基因芯片非相关人员培养的15份细胞培养菌株培养皿(包含鹦鹉热衣原体：6BC株、CP3株、NJ1株、GR9株；沙眼衣原体：D/UW-3/CX株；肺炎衣原体：N16株；流产衣原体：B577株；鼠衣原体：Mopn株以及阴性纯细胞培养物)进行盲测；选取临床采集的80份病料(包含咽喉拭子、肺泡灌洗液、胎膜、阴道分泌物)进行检测，以上检测同时用测序法结果比对，从而验证本发明基因芯片的准确性和符合性。

3、结果：

用本发明鹦鹉热衣原体基因型特异性基因芯片对标准菌株细胞培养样本以及临床疑似病料样本进行检测，并与生工生物工程(上海)股份有限公司对相应衣原体ompA基因的测序结果进行比对，芯片法与测序法检测结果如表8所示。

表8衣原体种属特异性基因芯片的样本检测以及符合性验证

统计芯片法检测样本的符合率如下：

样品类型样本量基因芯片检测结果与测序结果的符合率细胞培养菌株15皿100％临床采集病理样品45份97.78％

图4为细胞培养菌株以及临床疑似病料所提取的基因组进行基因芯片检测的结果。

4、从该基因芯片检测结果与测序结果的符合率统计得出：该芯片针对背景比较简单、干净的细胞培养物样品，检测的准确性与符合性可达100％，在临床采集的背景复杂且病原载量相对很低的病料检测方面，芯片检测的准确性与符合性可达97.78％。因此，可判断本发明的鹦鹉热衣原体基因型特异性基因芯片的准确性和符合性都相对很高，不仅能用于实验室诊断研究，也可以在实际中准确检测样品。

实施例5鹦鹉热衣原体种特异性检测芯片的特异性评价

本实施例用于对衣原体种特异性检测芯片进行特异性评价。选择流产衣原体，肺炎衣原体，沙眼衣原体，猪衣原体，家畜衣原体，大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎支原体和H₉N₂禽流感病毒作为C.psittaci基因型检测芯片的特异性验证样本。利用上述制备的鹦鹉热衣原体基因型特异性诊断基因芯片进行检测，验证该基因芯片的特异性。其中，病毒样品提取病毒RNA后，先将RNA反转录成cDNA，再进行PCR和芯片检测。

1、材料：

菌种来源：

鹦鹉热衣原体CB3株(基因型A)、鹦鹉热衣原体CP3株(基因型B)、鹦鹉热衣原体9N株(基因型D)、肺炎衣原体、沙眼衣原体、肺炎支原体、大肠杆菌、H9N2。

细菌基因组DNA提取试剂盒：全式金生物技术(北京)有限公司的EasyPureBacteria Genomic DNA Kit，货号：EE161-01。

基因芯片：实施例2制备的试剂盒。

2、方法：

用衣原体种属特异性基因芯片在优化的条件下进行检测，验证该基因芯片的特异性。

3、结果如图5所示，上述常见病原体的检测结果均为阴性，说明该基因芯片特异性良好。

本发明所述的基因芯片特异性良好，针对每个单独的菌种或者模拟临床实际多种衣原体混合感染的情况下，进行鹦鹉热衣原体基因型特异性检测，芯片依然能区分并鉴定鹦鹉热衣原体的基因型，达到良好的检测效果，适用于临床实际样品分析。

实施例6鹦鹉热衣原体种特异性检测芯片的灵敏度分析

本实施例用于对鹦鹉热衣原体基因特异性基因芯片的灵敏性进行评价。

1、材料：

质粒标准品：实施例3制备的质粒；

基因芯片：实施例2制备的芯片；

2、方法

分别将以上所述实施例3中制备的鹦鹉热衣原体各基因型质粒标准品设置稀释浓度梯度，检测基因芯片的敏感性和最低检测限度。浓度分别为10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL，采用优化后的芯片反应体系进行芯片检测。

3、结果

结果表明本发明的鹦鹉热衣原体基因型检测芯片对鹦鹉热衣原体A、B、C、D、E、E/B、F、WC、M56各基因型的检测限为2×10³copies/反应(2指PCR反应时添加的质粒模板的量)，故本发明的基因芯片检测各种衣原体的最低检测限为2×10³copies/反应，性能较优。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 用于鹦鹉热衣原体基因型检测的引物和探针组合及应用

<130> KHP191110709.9

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actacggaga ttatgttttc gatcgtgt 28

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtgcaccya cgctccaaga 20

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggngcwgmnt tccaataygc ncartc 26

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccttagaat ctgaattgag c 21

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggttttcagc tgcaagctca atctc 25

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccaagcctt ataggatcaa ccactg 26

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctaccaact caacctctac cgatct 26

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agctccttaa caaatgacca acttccc 27

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggcctctgc tgttatgaac ttgac 25

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcaataatca acttccaaac gtagccatca 30

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgtcgacggt accaatactt actctga 27

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgagcttcca atgcaacttc ctaac 25

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

actactttgc ccaataatgg tggtaagg 28

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccagctcaac ctctaccgag ct 22

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccgtagcagc tgatcaactt cca 23

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agctttagat gctagcaaca aattctgc 28

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agccgctgct gttttgaact tga 23

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggaattgctg gaaatagcga aagtaatgc 29

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tggctactgc tgttttagac gca 23

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

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<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

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<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggngcwgmnt tccaataygc ncartc 26

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tttttttttt tttttttttt 20