一种香蕉果实糖原起始合成酶基因MaGN12及其编码蛋白质和应用

摘要

本发明提供了一种香蕉果实糖原起始合成酶基因MaGN12，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了香蕉果实糖原起始合成酶基因MaGN12编码的蛋白质及应用。本发明的香蕉果实糖原起始合成酶基因MaGN12能够改善果实甜味品质，提高果实葡萄糖和果糖含量，例如将其导入番茄中，获得35S启动子驱动的MaGN12转基因番茄8个独立株系，过量表达基因MaGN12提高了GN酶活性、MaGN12表达量、糖原含量、果糖和葡萄糖含量，对调控果实品质、培育优质香蕉新品种具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明生物技术领域，具体涉及一种香蕉果实糖原起始合成酶基因MaGN12及其编码蛋白质和应用。

背景技术

糖原是由葡萄糖组成的带分枝的大分子多糖，广泛贮存于人体、动物、真菌、细菌、植物组织中。在人体心脏和骨骼肌中糖原的缺失导致心肌病和肌无力；动物糖原主要是控制血糖的稳态；真菌和细菌中的糖原主要是以基础能量的形式存在，在需要时可短时间内快速大量动用，不需要时快速恢复贮存。植物糖原是植物缺失异淀粉酶型突变体(sul突变体)内存在的一种可溶性的α-D-葡聚糖，是植物体内最主要的贮存多糖，是植物所有器官碳架构成的基础物质。

糖原合成是一个复杂的生化反应过程，需要一系列酶的广泛参与，如：糖原起始合成酶(Glycogenin,GN)，糖原合酶(Glycogen Synthase,GS)，糖原分支酶(GlycogenBranching Enzyme,GBE)及糖原磷酸化酶(Glycogen Phosphorylase,GP)。GN是启动糖原合成的第一个限速酶。目前，大多数关于GN的研究主要集中在动物身上(Bischof et al.,2013；Li et al.,2017)，关于植物GN的信息很少，特别是对于重要的热带水果香蕉，至今未见GN的相关报道。因此，开展香蕉基因MaGN12的相关研究是全新的，同时对调控果实品质、培育优质香蕉新品种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种从巴西香蕉获得的可改良植物果实甜味品质的香蕉果实糖原起始合成酶基因MaGN12及其编码产物和应用。

本发明的第一个方面是提供一种香蕉果实糖原起始合成酶基因MaGN12，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的第二个方面是提供一种蛋白质，其为本发明第一个方面所述的香蕉果实糖原起始合成酶基因MaGN12编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的香蕉果实糖原起始合成酶基因MaGN12在改良植物果实甜味品质中的应用。

其中，过表达所述香蕉果实糖原合成起始酶基因MaGN12提高了MaGN12基因表达量、GN酶活性、糖原含量、葡萄糖和果糖含量。

本发明的第四个方面是提供一种表达载体，其包含原始载体和本发明第一个方面所述的香蕉果实糖原起始合成酶基因MaGN12。

其中，所述原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pBI121载体质粒，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。

优选地，所述原始载体为pBI121载体质粒，SEQ ID NO:1所示核苷酸序列位于pBI121载体质粒的Xba I和Sac I两限制性内切酶位点之间。

本发明的第五个方面是提供如本发明第四个方面所述的表达载体在改良植物果实甜味品质中的应用。

其中，本发明第四个方面所述的表达载体提高了MaGN12表达量、GN酶活性、糖原含量、葡萄糖和果糖含量。

本发明的第六个方面是提供一种提高番茄果实中抗性淀粉品质的应用方法，用本发明第四个方面所述的表达载体重组质粒转化番茄叶盘。

本发明的第七个方面是提供一种用于扩增香蕉果实糖原起始合成酶基因MaGN12的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

本发明的香蕉果实糖原起始合成酶基因MaGN12能够改善果实甜味品质，提高果实葡萄糖和果糖含量，例如将其导入番茄中，获得35S启动子驱动的MaGN12转基因番茄8个独立株系，过量表达基因MaGN12提高了GN酶活性、MaGN12表达量、糖原含量、果糖和葡萄糖含量，对调控果实品质、培育优质香蕉新品种具有重要意义。

附图说明

图1为香蕉果实糖原起始合成酶基因MaGN12扩增电泳结果图，其中，M：DL2000DNAMarker；泳道1：基因MaGN12PCR产物。

图2为pBI121-MaGN12双酶切验证电泳结果图，其中，M：DL2000DNA Marker，泳道1：pBI121-MaGN12重组质粒双酶切结果。

图3为MaGN12转基因番茄株系的PCR检测(A)以及花和果实形状(B)、GN酶活性(C)、果糖含量(D)、MaGN12基因表达(E)和葡萄糖含量(F)的变化。其中，M：DL2000DNA Marker，泳道1：阳性对照，泳道2：野生型(阴性对照)。WT：野生型；VC：pBI121载体；GN-3、GN-14、GN-22：MaGN12转基因植株；*代表MaGN12转基因植株与野生型的数值达到了差异显著水平(*p<0.05；**p<0.01)。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。

一、基因获得

以巴西蕉果实cDNA为模板，以

5’-GCTCTAGAGATGATGTACATGGGGAC-3’

5’-CGAGCTCGGTTAATACAGTTTGTTGAACTCAG-3’

为引物，通过PCR方法扩增获得的一种含有碱基序列为1407bp(图1)，其序列如SEQID No:1所示；编码MaGN12基因的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

二、表达载体构建

将上述香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaGN12的核苷酸序列，利用Xba I和Sac I两种限制性内切酶分别对目的片段及pBI121载体质粒双酶切，将酶切后的目的片段与植物表达载体pBI121片段进行回收、连接、转化及测序验证正确，即得香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaGN12的表达载体(图2)。

三、表达载体转化至番茄叶盘

用上述的表达载体重组质粒通过农杆菌转化至番茄叶盘。农杆菌叶盘转化法具体实验步骤如下：

(1)pBI121-MaGN12载体的农杆菌转化：

取200μL冰浴上融化的根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，加入pBI121-MaGN12重组质粒2μg，轻轻混匀，在冰浴中放置30min；转入液氮中冷冻3min，迅速置37℃水浴中温育5min；加入800μL YEP液体培养基，28℃，250rpm预培养4～5h；吸取300μL菌液至含有50mg/LRif的YEP固体选择培养基上，均匀涂布于整个平板；将平板置于28℃至液体被吸收，倒置平板，28℃培养2～3天，挑选单菌落，验证检测，将转化正确的农杆菌菌液用于下一步实验。

(2)根癌农杆菌介导番茄遗传转化：

在超净工作台上将番茄种子浸泡于5mL 75％乙醇的无菌离心管中1min，浸泡期间充分晃动，然后用无菌水冲洗三次；20％次氯酸钠溶液浸泡15min，浸泡期间充分晃动，用无菌水冲洗三次；将番茄种子置于无菌滤纸上，晾干水分，播种于MS固体培养基中，于25℃，黑暗条件下培养4～5天；当种子开始萌发后，将其转移到25℃，1800LUX光照强度，16h光照，8h黑暗条件下培养；待其长出两片子叶时，用无菌刀片切取约0.5×0.5cm²大小的叶片置于番茄分化培养基(MS固体培养基+2.0mg/L>

四、转化株系的检测

(1)番茄基因组DNA提取及阳性转化植株检测

使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，天根生化科技(北京)有限公司)提取转化番茄基因组DNA，其具体实验方法见说明书。

(2)转化番茄株系PCR鉴定

为进一步检测外源基因MaGN12在番茄基因组中的整合，以转化番茄植株为材料，以非转化WT野生型番茄植株为阴性对照，以转化使用的菌株质粒为阳性对照，对转化番茄株系进行PCR鉴定，其具体实验方法步骤如下：

a、在0.2mL PCR管中加入下列试剂：

轻弹混匀，瞬时离心，然后按下列程序进行PCR扩增：

1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。凝胶成像系统观察和记录电泳结果。

结果如图3所示，阳性质粒有条带，野生型WT没有条带，而转MaGN12基因株系GN-3、GN-6、GN-14、GN-16、GN-20、GN-21、GN-22和GN-23能够清楚地分辨出单一条带，证明MaGN12基因已成功转化至番茄基因组，且GN-3、GN-14和GN-22株系的条带较亮。

(3)不同发育时期番茄果实GN酶活性检测

以转基因株系不同发育阶段的果实为材料，分成小份加入PBS(PH7.4)，快速液氮冷冻后备用。取1g的样品加入足够的PBS(PH7.4)，然后将标本充分匀浆。大约离心20min(2000-3000rpm/min)后小心地收集上清。其具体操作步骤如下：

①标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

②在酶标包被板上设置好样品孔和空白对照孔(空白孔里没有样品和酶标试剂，其余步骤相同)位置，在样品孔中加40μL的样品稀释液，再加样品10μL(使样品最终稀释5倍)。添加样品时，将样品加入酶孔的底部，尽量不要接触孔壁,轻轻摇匀。

③除空白孔外，每孔加100μL的酶标试剂。

④密封板后，将板放置在置37℃条件下等待60min。

⑤用蒸馏水稀释20×浓缩洗涤液。

⑥慢慢揭下封板膜，把里面液体倒掉后甩干，用洗涤液填满每个孔，30秒后倒掉，这样重复5次后拍干。

⑦每孔分别加入50μL的显色剂A和B，先加试剂A，慢慢混匀后37℃避光条件下放置15min。

⑧每孔都加50μL的终止液终止反应后用酶标仪测定OD值。

⑨测定用空白管调零，设置条件为450nm波长。

结果如图3所示，与野生型相比较，转基因株系GN-3、GN-14和GN-22在幼果期、绿熟期、转色期和红熟期GN酶活性分别增加了约13～15U/g、28～45U/g、13～14U/g和11～15U/g。

(4)不同发育时期番茄果实果糖和葡萄糖含量测定

以转化MaGN12基因的番茄株系，转pBI121空载体的番茄株系和野生型WT番茄株系的不同发育阶段的果实为材料，0.5％亚硫酸氢钠中护色10，40℃恒温干燥至恒重(约24h)，研磨成粉状备用。准确称取粉末300mg于2mL离心管中，加入1.5mL蒸馏水在80℃水浴30min，10000r/min离心10min，转移上清液至50mL离心管，然后用1mL蒸馏水提取残渣两次；上清液中加入15mL无水乙醇，充分混合均匀，-4℃过夜放置沉淀蛋白；10000r/min离心10min，转移上清液至小烧杯，80℃完全干燥溶液；加入2mL超纯水溶解，-20℃过夜并离心至无残渣；用5毫升注射器吸取样品并用0.25nm孔水系滤膜针头过滤注入到样品瓶中，等待上机。

用waters2695-3300ELSD高效液相色谱仪检测糖组分及其含量，色谱条件为:流动相为乙腈:氨水(0.1％)＝75:25(V:V)，柱子为氨基柱，流速1mL/min，设置进样量10μL、柱温30℃，计算果实中果糖和葡萄糖含量。

结果如图3所示，与野生型相比较，转基因株系GN-3、GN-14和GN-22在红熟期果糖含量分别增加了约90mg/g、30mg/g和40mg/g。与野生型相比较，转基因株系GN-3、GN-14和GN-22在红熟期葡萄糖含量分别增加了约20mg/g、30mg/g和25mg/g。

(5)MaGN12基因在番茄中的表达分析

以MaGN12转基因株系和野生型幼果期、绿熟期、转色期和红熟期不同发育阶段(Alba et al.，2005)的果实cDNA为模板，对MaGN12基因在番茄不同发育阶段中的表达进行分析，其反应体系及具体实验方法如下：

在200μL的PCR管中加入以下个组分，其反应体系如下：

吸打混匀，瞬时离心数秒，然后于实时荧光定量PCR仪(Mx3000P，Stratagene)中以MaActin为内参基因进行扩增检测，每个样品重复三次，扩增反应运行程序如下：

结果如图3所示，与野生型相比较，转基因株系GN-3、GN-14和GN-22在幼果期、绿熟期、转色期和红熟期MaGN12基因的相对表达量分别增加了约8～12倍、26～51倍、8～10倍和3～6倍。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 一种香蕉果实糖原起始合成酶基因MaGN12及其编码蛋白质和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

atggaaatca agttgcgact ggggttactt gcggcgctgc ttttggcgct agcagcggct 60

gcggcggagg cgacgacgac agagaggcgg cggcggcacg cgtacgcggc gatgatgtac 120

atggggacac ccagggacta cgagttctac gtggcgacga gggtgatgat gaggtccctc 180

gcgaggctcc acgtcgaggc cgatctcgtc gtcatcgcct ccgtcgacgt ccccgtccga 240

tgggcccaaa ccttgcaaga ggaggatggg gtgaaggtga ttagagttga gaacttgaag 300

aacccgtatg aaaatcaaca aaacttcaac accagattca agttgacatt gaacaaactt 360

tatgcatgga gtctaatttc gtatgatcga gttgttatgc tcgactccga taacattttc 420

ctccaacgta ccgatgagct tttccaatgc ggccaatttt gtgctgtttt catcaaccca 480

tgcatctttc atactggact tttcgttctt cagccttcaa tggatgtttt caagaacatg 540

cttcatgagc tagtaattgg acatgagaac ccagatggtg cagatcaagg cttcctggca 600

agctattttc ctgacttgct tgatcgtcca atgttccatc cacctaccaa tggtaccaag 660

ctttatggta cctatcgcct tcctttggga taccagatgg atgcttcata ttactatcta 720

aagctccggt ggagcatacc ttgtggacca aatagtgtga tcgcattccc aagtgcccca 780

tggttaaaac cttggtactg gtggtcttgg cctgttttac cattgggcct ttcatggcat 840

gagcgacgtc gaaagaatct cgggtatggt tcagagctac caatattgct gatccaagca 900

gtgatgtata ttggaatcat agcaattacc cggttggcac gaccaagttt gtcaaagctc 960

tgttataatc ggcgtccaga gaagatcaac gcaatattgc atagcacgct caaggttgca 1020

gcattgtggt ccatattcgc tgcatacacg gtaccttttt tcctcatccc acgttcggtg 1080

catccactct tgggttggcc catttatgtg ctcggagttg cttctctttc ttcaatcgtt 1140

atcaatgtct tccttctgcc acctctaccg gtccttacag tgttactggg aatcttgggt 1200

tcactgtttg tgatggcatt cccttggtat tctgatggtg ttattagggc tttggtggtg 1260

tttgcttatg ccctcagctg tgctccgatc gcatgggcgt ctttgatgaa ggtgataggc 1320

tccttgcaga acctacttga gagggaggcc ttctttccaa gactgggaga gtccccacaa 1380

ctgtctgagt tcaacaaact gtattaa 1407

<210> 2

<211> 468

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 2

Met Glu Ile Lys Leu Arg Leu Gly Leu Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala

1 5 1015

Leu Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Thr Thr Thr Glu Arg Arg Arg Arg

202530

His Ala Tyr Ala Ala Met Met Tyr Met Gly Thr Pro Arg Asp Tyr Glu

354045

Phe Tyr Val Ala Thr Arg Val Met Met Arg Ser Leu Ala Arg Leu His

505560

Val Glu Ala Asp Leu Val Val Ile Ala Ser Val Asp Val Pro Val Arg

65707580

Trp Ala Gln Thr Leu Gln Glu Glu Asp Gly Val Lys Val Ile Arg Val

859095

Glu Asn Leu Lys Asn Pro Tyr Glu Asn Gln Gln Asn Phe Asn Thr Arg

100 105 110

Phe Lys Leu Thr Leu Asn Lys Leu Tyr Ala Trp Ser Leu Ile Ser Tyr

115 120 125

Asp Arg Val Val Met Leu Asp Ser Asp Asn Ile Phe Leu Gln Arg Thr

130 135 140

Asp Glu Leu Phe Gln Cys Gly Gln Phe Cys Ala Val Phe Ile Asn Pro

145 150 155 160

Cys Ile Phe His Thr Gly Leu Phe Val Leu Gln Pro Ser Met Asp Val

165 170 175

Phe Lys Asn Met Leu His Glu Leu Val Ile Gly His Glu Asn Pro Asp

180 185 190

Gly Ala Asp Gln Gly Phe Leu Ala Ser Tyr Phe Pro Asp Leu Leu Asp

195 200 205

Arg Pro Met Phe His Pro Pro Thr Asn Gly Thr Lys Leu Tyr Gly Thr

210 215 220

Tyr Arg Leu Pro Leu Gly Tyr Gln Met Asp Ala Ser Tyr Tyr Tyr Leu

225 230 235 240

Lys Leu Arg Trp Ser Ile Pro Cys Gly Pro Asn Ser Val Ile Ala Phe

245 250 255

Pro Ser Ala Pro Trp Leu Lys Pro Trp Tyr Trp Trp Ser Trp Pro Val

260 265 270

Leu Pro Leu Gly Leu Ser Trp His Glu Arg Arg Arg Lys Asn Leu Gly

275 280 285

Tyr Gly Ser Glu Leu Pro Ile Leu Leu Ile Gln Ala Val Met Tyr Ile

290 295 300

Gly Ile Ile Ala Ile Thr Arg Leu Ala Arg Pro Ser Leu Ser Lys Leu

305 310 315 320

Cys Tyr Asn Arg Arg Pro Glu Lys Ile Asn Ala Ile Leu His Ser Thr

325 330 335

Leu Lys Val Ala Ala Leu Trp Ser Ile Phe Ala Ala Tyr Thr Val Pro

340 345 350

Phe Phe Leu Ile Pro Arg Ser Val His Pro Leu Leu Gly Trp Pro Ile

355 360 365

Tyr Val Leu Gly Val Ala Ser Leu Ser Ser Ile Val Ile Asn Val Phe

370 375 380

Leu Leu Pro Pro Leu Pro Val Leu Thr Val Leu Leu Gly Ile Leu Gly

385 390 395 400

Ser Leu Phe Val Met Ala Phe Pro Trp Tyr Ser Asp Gly Val Ile Arg

405 410 415

Ala Leu Val Val Phe Ala Tyr Ala Leu Ser Cys Ala Pro Ile Ala Trp

420 425 430

Ala Ser Leu Met Lys Val Ile Gly Ser Leu Gln Asn Leu Leu Glu Arg

435 440 445

Glu Ala Phe Phe Pro Arg Leu Gly Glu Ser Pro Gln Leu Ser Glu Phe

450 455 460

Asn Lys Leu Tyr

465

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

gctctagaga tgatgtacat ggggac 26

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

cgagctcggt taatacagtt tgttgaactc ag 32