一种基于调控微管聚集的靶向性多肽-葫芦脲超分子组装体及其制备方法及应用

摘要

一种基于调控微管聚集的靶向性多肽‑葫芦脲超分子组装体及其制备方法及应用。其特征在于：苄基咪唑通过化学修饰到多肽的骨架上，不仅保留了多肽靶向微管蛋白的能力，还为苄基咪唑与CB[8]的非共价包结提供了锚点。形态学研究表明，微管的自组装形貌通过

说明书

技术领域

本发明涉及癌症及肿瘤治疗技术领域，特别是一种基于调控微管聚集的新型靶向性多肽-葫芦脲超分子组装体及其在癌症治疗方面的潜在应用。

背景技术

具有空腔的合成大环(例如环糊精、杯芳烃、葫芦脲、柱芳烃等)已被证明可以作为一种强有力的策略来模拟和调节许多天然生物大分子的结构和功能，例如核酸和蛋白质。特别是，大环主体特异性识别分子结合位点的性质可以作为调节蛋白质-蛋白质相互作用的有效手段。因此，大环-蛋白质超分子组装体的多样性和复杂性在控制能量转移、生物催化/传感、形态相互转换和细胞活力调节等领域都显示出了巨大的潜力。微管(MTs)是细胞骨架的关键蛋白丝，由球状α/β-微管蛋白异二聚体以高度动态的方式构成。MTs的聚合和解聚与细胞分裂和细胞内的转运过程密切相关，所以微管成了肿瘤化疗的分子靶点和生物分子组装的对象。除了一些已知的天然产品，如MT稳定剂/不稳定剂(如紫杉醇和长春花生物碱)。以微管蛋白为靶标的生物肽因其可以避免常规化疗药物的细胞毒性和耐药性等方面的巨大优势，已成为创新药物发现和开发的主要选择。因此，靶向的多肽-葫芦脲超分子组装体为我们提供了一种简便的超分子方法来增强分子水平上的蛋白质-蛋白质相互作用，它可能被发展成为治疗癌症等许多退行性疾病的有效疗法。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术分析和存在问题，提供了一种基于调控微管聚集的新型靶向性多肽-葫芦脲超分子组装体，并研究了其在癌症治疗方面的潜在应用。该体系是基于苄基咪唑共价修饰的抗有丝分裂多肽(BP)和CB[8]之间的主客体相互作用构筑的，抗有丝分裂多肽通过与微管中的α-tubulin亚基竞争结合，显示出微管靶向性，CB[8]通过与苄基咪唑形成1：2的络合物来诱导微管聚集，从而可以作为抗微管聚集相关疾病的一种新的策略。

本发明的技术方案：

一种基于调控微管聚集的靶向性多肽-葫芦脲超分子组装体，其构筑单元以CB[8]为主体，以苄基咪唑共价修饰的多肽BP为客体，通过超分子主客体相互作用构筑了多肽-葫芦脲超分子组装体，其构筑单元的化学结构式如下：

一种基于调控微管聚集的靶向性多肽-葫芦脲超分子组装体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、苄基咪唑修饰的抗有丝分裂多肽BP的制备；

步骤2、二元多肽-葫芦脲超分子组装体溶液的制备和表征；

步骤3、二元多肽-葫芦脲超分子组装体诱导微管体外聚集的制备和表征；

步骤4、二元多肽-葫芦脲超分子组装体诱导细胞和活体内微管的聚集实验。

其中微管蛋白来源于猪脑，纯度大于99％，在重新使用之前储存在4℃的环境中。

进一步的，其中步骤1中苄基咪唑修饰的抗有丝分裂多肽BP的制备方法如下：

1)丙氨酸修饰的苄基咪唑中间体BA的合成

将化合物2-氯乙酰胺丙酸0.27mmol、44.6mg和1-苄基咪唑0.29mmol、46.3mg的反应混合物溶解在1，4-二氧六环中，在110℃下搅拌16小时，然后在减压下除去溶剂；将固体溶解在甲醇中，然后加入活性炭；16小时后，通过过滤除去活性炭；减压浓缩滤液得到固体，用乙酸乙酯和甲醇进行再沉淀纯化，得到黄色固体丙氨酸修饰的苄基咪唑中间体；

2)苄基咪唑修饰的抗有丝分裂多肽BP的合成

BP通过丙氨酸修饰的苄基咪唑中间体BA和抗有丝分裂靶向微管蛋白的多肽反应合成。

进一步的，其中步骤2中二元多肽-葫芦脲超分子组装体溶液的制备和表征如下：

1)二元多肽-葫芦脲超分子组装体溶液的制备

将BP和CB[8]固体样品按照2：1的化学计量比进行称量，溶解在氘代水/二次水中，超声20分钟，使其充分溶解和组装；

2)二元多肽-葫芦脲超分子组装体的表征

将配制好的二元多肽-葫芦脲超分子组装体氘代水溶液，进行核磁滴定表征，分析二元多肽-葫芦脲超分子组装体的组装模式和键合常数，其中，BP的浓度固定为1.5×10^-3M^-1,CB[8]的浓度分别为0,1.5×10^-4M^-1,3.0×10^-4M^-1,4.5×10^-4M^-1,6.0×10^-4M^-1,7.5×10^-4M^-1,9.0×10^-4M^-1,和1.2×10^-3M^-1。

进一步的，其中步骤3中二元多肽-葫芦脲超分子组装体诱导微管体外聚集的制备和表征：

1)二元多肽-葫芦脲超分子组装体诱导微管体外聚集的制备

将BP和CB[8]固体样品按照2：1的化学计量比溶解在常规的微管蛋白缓冲液中，超声20分钟，使其充分溶解和组装；将微管蛋白溶解在常规的微管蛋白缓冲液中，对其进行重建，初始浓度为10mg/ml；将二元多肽-葫芦脲超分子组装体和微管蛋白缓冲液混合在一起稀释至实验浓度后，37℃下放置15min，得到@MT三元混合物；所述常规的微管蛋白缓冲液组成为：8×10^-2M^-1PIPES、6×10^-3M^-1MgCl₂、1×10^-3M^-1EGTA、5％glycerol、5×10^-3M^-1GTP，其pH为6.9；

2)二元多肽-葫芦脲超分子组装体诱导微管体外聚集的表征

TEM电镜表征：将5μL的样品液滴在碳支持膜上，静置、室温晾干表征微观在体外聚集的形貌；DLS粒径表征：将样品溶液置于闪烁管中，25℃，λ＝636nm激光下测定样品液的粒径；UV-vis光学透过率：37℃下，将样品液放置在光路为10mm石英比色皿中进行测试。

进一步的，其中步骤4中二元多肽-葫芦脲超分子组装体诱导细胞和活体内微管聚集的实验：

1)二元多肽-葫芦脲超分子组装体诱导细胞内微管聚集的实验

将A549肺癌细胞置于96孔板中，在含10％的FBS的F12培养基中培养24h，然后分别加入BP和的组装体，细胞继续培养24h；细胞死亡率通过碘化丙啶PI染色和荧光来测定，通过PI阳性细胞数除以每个孔中总细胞数，计算PI阳性细胞百分率，细胞存活率用CCK-8酶法测定；此外，还以磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH为内参照，评估了最重要的与细胞凋亡相关蛋白酶caspase-3的表达；

2)二元多肽-葫芦脲超分子组装体诱导活体内微管聚集从而抑制肿瘤生长的实验

将100μL的S180细胞悬液，浓度为10⁷cells/mL，皮下接种到每个4周龄雌性BALB/c小鼠体内，接种7d后，将0.06mmol/kg的BP和组装体每2天一次直接注射到肿瘤部位，治疗12天后，从小鼠体内取肿瘤标本，称重，用4％甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，然后用TUNEL试剂盒对切片进行染色，并在荧光显微镜下观察；所述的组装体组成为0.06mmol/kg的BP和0.03mmol/kg的CB[8]。

本发明的优点是：1)含有10个氨基酸残基的多肽能够与α-tubulin亚基进行竞争性结合，显示出抗有丝分裂的活性，同时也表现出其靶向能力；2)苄基咪唑部分对多肽的化学修饰，不能干扰多肽原有的微管蛋白靶向能力，同时又能为与CB[8]的非共价结合提供功能上的锚点；3)单独的BP和CB[8]均无毒，但组装体通过聚集微管，具有较高的细胞毒性；4)该超分子纳米组装体的制备方法简单、易于实施且效果特别好，使其在抑制肿瘤生长、癌症治疗方面具有潜在的应用。

附图说明

图1为丙氨酸修饰的苄基咪唑中间体BA的合成路线图。

图2为@MT三元超分子组装体靶向微管聚集的示意图。

图3为丙氨酸修饰的苄基咪唑中间体BA的核磁氢谱谱图。

图4为丙氨酸修饰的苄基咪唑中间体BA的碳谱谱图。

图5为丙氨酸修饰的苄基咪唑中间体BA的高分辨质谱图。

图6为苄基咪唑修饰的多肽BP的核磁氢谱谱图。

图7为苄基咪唑修饰的多肽BP的高分辨质谱图。

图8为苄基咪唑修饰的多肽BP的高效液相色谱图。

图9为二元超分子组装体在水溶液中的分子键合模式核磁氢谱表征图。

图10为BP随着CB[8]浓度不断增大的核磁滴定谱图。

图11为BP和CB[8]的Job图。

图12为@MT三元超分子组装体在普通微管蛋白缓冲溶液中的形貌和结构表征图。

图13为@MT三元超分子组装体在普通微管蛋白缓冲溶液中的粒径分布图。

图14为@MT三元超分子组装体在普通微管蛋白缓冲溶液中的光学透过率图。

图15为超分子组装体诱导细胞内微管聚集，从而抑制细胞增殖的实验。(a)A 549细胞的共聚焦荧光图像；(b)细胞存活率；(c)PI阳性细胞比率；(d)裂解半胱天冬酶-3与GAPDH的比值；(e)超分子络合物诱导的细胞凋亡。

图16为超分子组装体诱导活体内微管聚集，从而抑制小鼠肿瘤生长的实验。(a)体内抗癌实验结束时肿瘤的照片；(b)治疗后肿瘤的重量变化；(c)肿瘤组织TUNEL共聚焦荧光图像；(d)治疗后TUNEL阳性细胞/细胞总数的比值。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步的说明：

实施例：

一种基于调控微管聚集的靶向性多肽-葫芦脲超分子组装体，其构筑单元以CB[8]为主体，以苄基咪唑共价修饰的多肽(BP)为客体，通过超分子主客体相互作用构筑了多肽-葫芦脲超分子组装体，其构筑单元的化学结构式如下：

一种基于调控微管聚集的靶向性多肽-葫芦脲超分子组装体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、苄基咪唑修饰的抗有丝分裂多肽(BP)的制备；

步骤2、二元多肽-葫芦脲超分子组装体溶液的制备和表征；

步骤3、二元多肽-葫芦脲超分子组装体诱导微管体外聚集的制备和表征；

步骤4、二元多肽-葫芦脲超分子组装体诱导细胞和活体内微管的聚集实验。

步骤1的苄基咪唑修饰的抗有丝分裂多肽(BP)的制备方法，步骤如下：

1)参见附图1，丙氨酸修饰的苄基咪唑中间体BA的合成

将化合物2-氯乙酰胺丙酸(0.27mmol，44.6mg)和1-苄基咪唑(0.29mmol，46.3mg)的反应混合物溶解在1，4-二氧六环中，在110℃下搅拌16小时，然后在减压下除去溶剂。将固体溶解在甲醇中，然后加入活性炭。16小时后，通过过滤除去活性炭。减压浓缩滤液得到固体，用乙酸乙酯和甲醇进行再沉淀纯化，得到黄色固体丙氨酸修饰的苄基咪唑中间体；

2)苄基咪唑修饰的抗有丝分裂多肽(BP)的合成

BP通过丙氨酸修饰的苄基咪唑中间体BA和抗有丝分裂靶向微管蛋白的多肽反应合成。

图3为丙氨酸修饰的苄基咪唑中间体BA的核磁氢谱谱图。图中表明：丙氨酸修饰的苄基咪唑中间体BA结构正确。

图4为丙氨酸修饰的苄基咪唑中间体BA的碳谱谱图。图中表明：丙氨酸修饰的苄基咪唑中间体BA结构正确。

图5为丙氨酸修饰的苄基咪唑中间体BA的高分辨质谱图。图中表明：丙氨酸修饰的苄基咪唑中间体BA结构正确。

图6为苄基咪唑修饰的多肽BP的核磁氢谱谱图。图中表明：苄基咪唑修饰的多肽BP结构正确。

图7为苄基咪唑修饰的多肽BP的高分辨质谱图。图中表明：苄基咪唑修饰的多肽BP结构正确。

图8为苄基咪唑修饰的多肽BP的高效液相色谱图。图中表明：苄基咪唑修饰的多肽BP结构正确。

本发明制备方法的步骤2中，二元多肽-葫芦脲超分子组装体溶液的制备和表征如下：

1)二元多肽-葫芦脲超分子组装体溶液的制备

将BP和CB[8]固体样品按照2：1的化学计量比进行称量，溶解在氘代水/二次水中，超声20分钟，使其充分溶解和组装。

2)二元多肽-葫芦脲超分子组装体的表征

将配制好的二元多肽-葫芦脲超分子组装体氘代水溶液，进行核磁滴定表征，分析二元多肽-葫芦脲超分子组装体的组装模式和键合常数。其中，BP的浓度固定为1.5×10^-3M^-1,CB[8]的浓度分别为0,1.5×10^-4M^-1,3.0×10^-4M^-1,4.5×10^-4M^-1,6.0×10^-4M^-1,7.5×10^-4M^-1,9.0×10^-4M^-1,和1.2×10^-3M^-1。

图9为二元多肽-葫芦脲超分子组装体分子键合模式的核磁氢谱表征图。图中表明：BP分子中的苄基咪唑部分与CB[8]形成了2：1的包合物，并且确定了包结模式如图中所画。

图10为BP随着CB[8]浓度不断增大的核磁滴定图。图中表明：BP分子中的苄基咪唑部分与CB[8]形成了2：1的包合物，并且确定了包结模式。

图11为BP和CB[8]的Job图。图中表明：BP分子中的苄基咪唑部分与CB[8]形成了2：1的包合物，并且确定了键合常数为Ks＝2.84×10⁷M^–2。

如图2所示，本发明制备方法的步骤3中，二元多肽-葫芦脲超分子组装体诱导微管体外聚集的制备和表征如下：

1)二元多肽-葫芦脲超分子组装体诱导微管体外聚集的制备

将BP和CB[8]固体样品按照2：1的化学计量比溶解在常规的微管蛋白缓冲液中(8×10^-2M^-1PIPES,6×10^-3M^-1MgCl₂,1×10^-3M^-1EGTA,5％glycerol,5×10^-3M^-1GTP,pH>二元多肽-葫芦脲超分子组装体和微管蛋白缓冲液混合在一起稀释至实验浓度后，37℃下放置15min，得到@MT三元混合物。

2)二元多肽-葫芦脲超分子组装体诱导微管体外聚集的表征

TEM电镜表征：将5μL的样品液滴在碳支持膜上，静置、室温晾干表征微观在体外聚集的形貌。DLS粒径表征：将样品溶液置于闪烁管中，25℃，λ＝636nm激光下测定样品液的粒径。UV-vis光学透过率：37℃下，将样品液放置在石英比色皿中(光路为10mm)进行测试。

图12为@MT三元超分子组装体在普通微管蛋白缓冲溶液中的形貌和结构表征图。图中表明：单独的BP不足以显著地改变微管的形貌，而大量的交联可以戏剧性地将微管的形貌从纤维状的纳米聚集体转变为颗粒状的纳米聚集体。

图13为@MT三元超分子组装体在普通微管蛋白缓冲溶液中的粒径分布图。图中表明：与单独的BP以及BP@MT相比，三元组装体@MT具有更大的粒径分布，说明@MT发生聚集形成了更大的组装体。

图14为@MT三元超分子组装体在普通微管蛋白缓冲溶液中的光学透过率图。图中表明：与单独的BP以及BP@MT相比，三元组装体@MT具有更小的光学透过率，说明@MT发生聚集形成了更大的组装体。

本发明制备方法的步骤4中，二元多肽-葫芦脲超分子组装体诱导细胞和活体内微管聚集的实验如下：

1)二元多肽-葫芦脲超分子组装体诱导细胞内微管聚集的实验

将A549肺癌细胞置于96孔板中，在含10％的FBS的F12培养基中培养24h，然后分别加入BP和的组装体，细胞继续培养24h。细胞死亡率通过碘化丙啶(PI)染色和荧光来测定，通过PI阳性细胞数除以每个孔中总细胞数，计算PI阳性细胞百分率。细胞存活率用CCK-8酶法测定。此外，还以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照，评估了最重要的与细胞凋亡相关蛋白酶caspase-3的表达。

2)二元多肽-葫芦脲超分子组装体诱导活体内微管聚集从而抑制肿瘤生长的实验

将100μL的S180细胞悬液(107cells/mL)皮下接种到每个4周龄雌性BALB/c小鼠体内。接种7d后，将BP(0.06mmol/kg)和组装体(0.06mmol/kg的BP和0.03mmol/kg的CB[8])直接注射到肿瘤部位(每2天一次)。治疗12天后，从小鼠体内取肿瘤标本，称重，用4％甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片。然后用TUNEL试剂盒对切片进行染色，并在荧光显微镜下观察。

图15为超分子组装体诱导细胞内微管聚集，从而抑制细胞增殖的实验。(a)A 549细胞的共聚焦荧光图像；(b)细胞存活率；(c)PI阳性细胞比率；(d)裂解半胱天冬酶-3与GAPDH的比值；(e)超分子络合物诱导的细胞凋亡。图中表明：组装体对A549肺癌细胞具有很高的毒性，并且证明络合物通过诱导微管之间的聚集，增强细胞环境中的细胞凋亡率，最终主要通过caspase依赖途径引起细胞死亡。

图16为超分子组装体诱导活体内微管聚集，从而抑制小鼠肿瘤生长实验。(a)体内抗癌实验结束时肿瘤的照片；(b)治疗后肿瘤的重量变化；(c)肿瘤组织TUNEL共聚焦荧光图像；(d)治疗后TUNEL阳性细胞/细胞总数的比值。图中表明：络合物的抗癌潜力在荷瘤小鼠模型中被进一步评估，络合物通过诱导微管之间的聚集，有效抑制荷瘤小鼠模型中肿瘤的生长，可以作为抗微管聚集相关疾病的一种新的策略。