苯乙烯基环己烯丙二腈衍生物在制备抗肺癌药物中的应用

摘要

本发明公开了一种化合物(E)‑2‑(5,5‑二甲基‑3‑(4‑(哌嗪‑1‑基)苯乙烯)环己‑2‑烯‑1‑亚甲基)丙二腈在抑制A549癌细胞生长，促进A549细胞凋亡与自噬药物中的应用，其中能够有效促进A549细胞凋亡与自噬的药物剂量为5～10μM。本发明提供的化合物有望作为一种有效的抑制肿瘤生长工具，为开发非小细胞肺癌治疗药物奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及苯乙烯基环己烯丙二腈衍生物在制备抗肺癌药物中的应用，尤其涉及荧光化合物(E)-2-(5,5-二甲基-3-(4-(哌嗪-1-基)苯乙烯)环己-2-烯-1-亚甲基)丙二腈(简略记为SCM)在抑制A549癌细胞生长，促进A549细胞凋亡与自噬药物中的应用。

背景技术

肺癌是全球造成癌症相关死亡的主要原因。肺部恶性肿瘤中约85％是非小细胞肺癌。近年来，肺癌的预防和治疗取得了很大进展，但非小细胞肺癌的诊断严重滞后，常常被确诊时即为晚期并且预后不良。常规的化疗和放疗可以获得最大治疗效果。小分子化合物可以作为肿瘤抑制因子，成为一种有前景的新治疗策略。自噬是细胞内通过溶酶体降解细胞质蛋白和细胞器的进化保守途径。自噬在重要的生物过程中实现了许多功能。自噬的功能多样性使其成为癌症研究中最具争议的话题之一。自噬在不同类型的癌症以及不同时段的肿瘤中的作用往往大相径庭。近几年的研究揭示了自噬缺陷对肿瘤恶性转化有促进作用，自噬在肿瘤发生以及治疗中具有重要的作用，自噬作为癌症治疗的靶点，对肿瘤治疗具有重要意义。

目前，最常用的自噬激活剂是雷帕霉素，它能够靶向哺乳动物雷帕霉素靶点mTORC1，抑制其活性，促进自噬。因此雷帕霉素成为研究自噬与肿瘤关系的有力工具。但也发现，临床上应用雷帕霉素时会加重某些疾病的发展。因此，迫切需要研发更多具有激活自噬活性的化合物或制剂。经检索，有关荧光化合物(E)-2-(5,5-二甲基-3-(4-(哌嗪-1-基)苯乙烯)环己-2-烯-1-亚甲基)丙二腈(简略记为SCM)在抑制A549癌细胞生长，促进A549细胞凋亡与自噬药物中的应用的专利还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种化合物(E)-2-(5,5-二甲基-3-(4-(哌嗪-1-基)苯乙烯)环己-2-烯-1-亚甲基)丙二腈(简略记为SCM)在抑制A549癌细胞生长，促进A549细胞凋亡与自噬药物中的应用。

本发明所述的化合物(E)-2-(5,5-二甲基-3-(4-(哌嗪-1-基)苯乙烯)环己-2-烯-1-亚甲基)丙二腈(简略记为SCM)在抑制A549癌细胞生长，促进A549细胞凋亡与自噬药物中的应用，其中所述(E)-2-(5,5-二甲基-3-(4-(哌嗪-1-基)苯乙烯)环己-2-烯-1-亚甲基)丙二腈的结构式如式(I)所示：

上述的应用中：所述(E)-2-(5,5-二甲基-3-(4-(哌嗪-1-基)苯乙烯)环己-2-烯-1-亚甲基)丙二腈能够有效促进A549细胞凋亡的剂量为5～10μM。

上述的应用中：所述(E)-2-(5,5-二甲基-3-(4-(哌嗪-1-基)苯乙烯)环己-2-烯-1-亚甲基)丙二腈能够有效促进A549细胞自噬的剂量为5～10μM。

上述化合物(E)-2-(5,5-二甲基-3-(4-(哌嗪-1-基)苯乙烯)环己-2-烯-1-亚甲基)丙二腈(简略记为SCM)抑制A549癌细胞生长，促进其自噬以及凋亡的细胞生物学实验及结果如下：

1.化合物SCM对A549细胞存活率的影响。

实验组：分别将浓度为0.1，1，5，10，20μM的SCM处理A549细胞24h以及48h。阴性对照：用DMSO(0.02％，v/v)，阳性对照：临床抗癌药物五氟尿嘧啶。

结果表明：在用5，10，20μM的SCM处理A549细胞24h以及48h后能够显著抑制A549细胞的存活，见图1。

2.化合物SCM对A549细胞细胞形态的影响。

实验组：分别用浓度为0.1，1，5，10，20μM的SCM处理A549细胞3h，6h，12h和24h后拍摄细胞形态变化。对照组：DMSO(0.02％，v/v)。

结果表明：在上述浓度与时间条件下，SCM能够减少A549细胞的数量并促进凋亡小体的释放，见图2。

3.化合物SCM对A549细胞的抑制作用与临床药物5FU相近。

实验组：分别计算化合物SCM以及5FU处理A549细胞48h的半抑制浓度(IC₅₀)。发现SCM的IC₅₀值约等于临床药物5FU，均为7.1μM。

4.荧光化合物SCM促进A549细胞凋亡。

实验组：分别用浓度为1，5和10μM的SCM处理A549细胞24h后，检测核糖聚合酶PARP蛋白切割情况。对照组：DMSO(0.02％，v/v)。

结果表明：上述条件下，SCM能够显著促进促进PARP蛋白切割，所以SCM能够显著促进A549细胞凋亡，见图3。

5.化合物SCM促进LC3-Ⅱ蛋白水平升高，促进自噬。

实验组：分别将浓度为1，5和10μM的SCM处理A549细胞24h后，检测轻链蛋白LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ蛋白水平变化情况。对照组：DMSO(0.02％，v/v)。

结果表明：上述条件下，SCM能够显著促进LC3-Ⅱ水平上升，所以会促进A549细胞自噬，见图4。

上述的实验数据统计学处理：

实验数据以平均值±标准误差表示，经t检验：P<0.05表示有显著性差异；P<0.01表示有极显著性差异。

由上述实验及其结果，可以得出如下结论：

SCM能够显著抑制A549细胞生长，并且抑制作用近似临床药物5FU。实验证实：一定浓度(1，5，10μM)的SCM能够显著促进A549细胞自噬与凋亡。预示SCM有望作为一种有效的抑制肿瘤生长工具，为开发非小细胞肺癌治疗药物奠定基础。

附图说明

图1：SCM抑制A549细胞存活。

其中A:SCM处理A549细胞24h后，检测A549细胞存活率。

B:SCM处理A549细胞4 8h后，检测A549细胞存活率。

图2：SCM促进A549形态改变并释放凋亡小体。

不同浓度SCM处理A549细胞3h，6h，12h和24h后，拍照观察A549细胞形态变化。

图3：SCM促进A549细胞凋亡。

不同浓度SCM处理A549细胞24h后，检测PARP蛋白切割水平。

图4：SCM促进A549细胞自噬。

不同浓度SCM处理A549细胞24h后，检测LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ蛋白水平。

具体实施方式

实施例1：SCM处理A549细胞后SRB法存活率检测。

(1)加入化合物SCM处理事先种于96孔板的细胞。(2)化合物处理24h以及48h后弃旧培养液，加入100μL的三氯醋酸，置于4℃固定细胞1h。(3)弃固定液。用双蒸水洗五遍，动作轻柔，室温晾干。(4)每孔加入50μL的SRB，室温摇床，10分钟。(5)用1％醋酸洗5遍，室温晾干。(6)每孔加入100μL浓度10mM/L的非缓冲液Tris碱，置于摇床10分钟。(7)选择540nm激发光，测OD值。

结果表明：5，10，20μM的SCM处理A549细胞24h以及48h后能够显著抑制A549细胞的存活，见图1。

实施例2：SCM处理A549细胞后，倒置显微镜下检测细胞形态变化。

将A549细胞接种于直径6cm的培养皿中，用37℃，CO₂孵箱内培养12h之后，加入SCM处理3h,6h,12h,以及24h后置于倒置显微镜下拍摄细胞形态。

结果表明：上述条件下，SCM能够减少A549细胞的数量并促进凋亡小体的释放。见图2。

实验例3：SCM处理A549细胞24h后，western blot检测凋亡情况。

将A549细胞接种于直径6cm的培养皿中，用37℃，CO₂孵箱内培养12h之后，加入SCM处理24h，裂解细胞，收集细胞裂解液，4℃下12000g离心15min，取上清，用western>

结果表明：分别用1，5，10μM的SCM处理A549细胞24h后，能够显著促进PARP蛋白切割，所以SCM能够显著促进A549细胞凋亡。见图3。

实施例4：SCM处理A549细胞后，western blot检测自噬水平。

将A549细胞接种于直径6cm的培养皿中，用37℃，CO₂孵箱内培养12h之后，加入SCM处理24h，裂解细胞，收集细胞裂解液，4℃下，12000g离心15min，取上清，用western>

结果表明：分别用1，5，10μM的SCM处理A549细胞24h后，显著促进LC3-Ⅱ水平上升，促进A549细胞自噬。见图4。