一种提高EGFP质粒转染效率的方法

摘要

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种提高EGFP质粒转染效率的方法。本发明提供的提高EGFP质粒转染效率的方法，主要是在细胞培养时，向营养液中加入由青霉素，四环素及氨基糖苷按质量比5：5：2组成的三抗，由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成的杀菌剂，提高质粒的纯度，避免各种杂菌的污染，同时，在转染过程中加一个1‑6h的静态或动态孵育过程，提高了EGFP质粒的转染效率。本发明提供的提高EGFP质粒转染效率的方法，可以显著提高EGFP质粒的转染效率，使EGFP质粒的转染达到80％以上的转染率，而且，本发明提供的转染方法操作过程简单，极大地节约了实验成本。

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种提高EGFP质粒转染效率的方法。

背景技术

悬浮细胞是指细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长，如淋巴细胞等。在实验室经常会遇到悬浮细胞的转染，其和贴壁细胞转染还是有很大不同的。

目前大多数实验室用的是脂质体类的转染试剂，脂质体转染是基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内，而脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍，所以，脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。其次，脂质体试剂的毒性较大，这就使得悬浮细胞的转染更为困难了。另外，悬浮细胞不易培养，易死亡，也给细胞转染造成了一定的困难。

为了提高悬浮细胞的转染效率，可以使用非脂质体的转染试剂，如engreen的Entranster试剂，纳米材料的。也可以使用电转染方法，针对悬浮细胞等难转染细胞还是挺不错的，电击对细胞有一定的损伤，最好选用具有细胞膜修复功能的电转染试剂，可以将电击对细胞的伤害降到最低，如Entranster-E。因此，悬浮细胞不易转染，选对试剂及良好的细胞培养环境是提高质粒转染效率的关键。

中国专利申请CN106676133A公开了一种基于磷酸钙-PEG的质粒转染方法，这种方法主要包括配制PEG-DNA溶液，PEG-DNA氯化钙溶液配制，PEG-磷酸钙转染复合物的配制及细胞转染等过程。该方法使用PEG能够增强DNA-磷酸钙复合物形成的稳定性，提高了质粒转染效率，但是，这种方法需要先将细胞置于半悬浮状态，且会消耗大量的聚乙二醇溶液，而且，操作过程复杂，导致实验成本较高。

综上可知，现有技术普遍存在质粒转染效率低，操作过程复杂，成本高等缺点。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种提高EGFP质粒转染效率的方法，该方法可以将EGFP质粒的转染效率提升至80％以上，而且操作过程简单，成本低。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种提高EGFP质粒转染效率的方法，包括如下步骤：

S1、细胞培养：将细胞复苏至T75放瓶中，使用含有0.8～2g的三抗及0.5～1.5g的杀菌剂的营养液，培养3代后，收获细胞状态较好的293T悬浮细胞，分别接种入3个摇瓶中进行培养，达到规定的细胞培养参数后，放入培养箱，设置好CO₂恒温振荡培养箱的培养参数，培养3代至细胞达到特定条件，得含悬浮细胞的混悬液；

S2、EGFP质粒转染293T悬浮细胞：将步骤S1所得含悬浮细胞的混悬液于1000～1500r/min的条件下离心1～10min，去除上清液，然后加入含EGFP质粒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；

S3、293T细胞的孵育培养：将步骤S2所得转染混悬液放入CO₂恒温振荡培养箱，设置好孵育培养参数，进行1～6h的静态或者动态孵育，孵育结束后加原体积一半的含有1％～20％牛血清及三抗的培养液进行培养，再设置好孵育后的培养参数，进行孵育后培养20～28h，得含EGFP质粒的混合液；

S4、转染后观察：将步骤S3所得含EGFP质粒的混合液于1000-1500r/min的速度下离心1～10min，弃掉全部上清液，加入不含血清的培养液，设置好换液后的培养参数，培养48～72h，取出细胞，在荧光显微镜下观察和使用流式细胞仪进行细胞转染率测定，即可。

进一步地，所述步骤S1中的杀菌剂由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成。

进一步地，所述步骤S1中细胞培养参数为接种密度在1.0×10⁵～30.0×10⁵个/mL，细胞活率为90％～100％；所述CO₂恒温振荡培养箱的培养参数为温度35～38℃，转速30～100r/min，CO₂浓度为3～7％；所述特定条件为细胞密度达到1～9×10⁶个/ml，细胞活率稳定在90％～100％。

进一步地，所述步骤S2中含EGFP质粒的转染混合液中EGFP质粒的量为100～1800μg。

进一步地，所述步骤S2中含EGFP质粒的转染混合液的总体积为10～90mL，pH值为6.0～7.4；所述步骤S2中含EGFP质粒的转染混合液包含质量浓度为2.5mg/mL的聚醚酰亚胺溶液，且聚醚酰亚胺溶液的加入量为0.5～4.5mL。

进一步地，所述步骤S1、S2中的三抗由青霉素，四环素及氨基糖苷按质量比5：5：2组成。

进一步地，所述步骤S3中的孵育培养参数为温度25～37℃，转速0～50r/min；所述孵育后的培养参数为温度35～38℃，转速50～100r/min，CO₂浓度3～7％。

进一步地，所述步骤S4中换液后的培养参数为温度35～38℃，转速10～80r/min，CO₂浓度3～7％。

与现有技术相比，本发明提供的提高EGFP质粒转染效率的方法，具有如下优点：

(1)本发明提供的提高EGFP质粒转染效率的方法，细胞培养时向营养液中加入了杀菌剂，可以避免杂菌污染，保证了质粒的单一性；

(2)本发明提供的提高EGFP质粒转染效率的方法，在T75放瓶及转染后孵育过程中加入了三抗，进一步避免了质粒受到污染的可能性；

(3)本发明提供的提高EGFP质粒转染效率的方法，将质粒的转染效率提升至80％以上，而且，操作过程极其简单，大大降低了实验成本。

附图说明

图1为细胞培养时，500mL摇瓶培养时，细胞密度生长曲线图；

图2为细胞培养时，500mL摇瓶培养时，细胞活率变化曲线图；

图3为常规方法与本发明的转染效果对比图；

图4为常规方法与本发明的转染率对比曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

实施例1一种提高EGFP质粒转染效率的方法

所述提高EGFP质粒转染效率的方法，包括如下步骤：

S1、转染前293T细胞培养：

细胞复苏：取一支来源于ATCC，可传代的冻存的293T细胞，迅速将其放入37℃的水浴中速溶，然后加入到10mL的含质量浓度为0.3g/L谷氨酰胺溶液、摩尔浓度为0.01mol/L的NaHCO₃溶液及质量浓度为0.1mg/mL的硫酸卡那霉素各0.1mL，100000IU青霉素0.1g、pH值为7.0的Sigma>293无血清营养液中，混合均匀，于1000r/min的条件下离心1min，去掉上清液，再加入10mL上述培养液重悬细胞，将重悬好的细胞接入T75的细胞瓶中，再补加10mL上述营养液，放入CO₂细胞培养箱中，于37℃条件下静置培养72h；

T75细胞瓶传代培养：待293T悬浮细胞长满T75方瓶，此时细胞密度为1.0×10⁵，细胞活率达到90％，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液，分装于三个T75规格细胞培养瓶内，每瓶补加含有由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成的杀菌剂0.5g，由青霉素，四环素及氨基糖苷按质量比5：5：2组成的三抗0.8g的新鲜Sigma>293无血清营养液到20mL，在35℃，3％的CO₂浓度的培养箱中培养，培养三代，选择生长状态良好的293T细胞，用吸管吹打培养瓶底制得细胞悬液，分别取样进行镜检和使用细胞计数仪进行细胞计数，取细胞活率在90％～100％的293T悬浮细胞，进行500mL摇瓶培养；向摇瓶中补加含有由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成的杀菌剂0.5g，由青霉素，四环素及氨基糖苷按质量比5：5：2组成的三抗0.8g的Sigma>293无血清营养液至100mL，其细胞活率达90％，细胞形态多为圆形和椭圆形，放在CO₂恒温振荡培养箱中培养，培养条件为：温度：35℃，转速：30r/min，CO₂浓度：3％，经72h培养后，先从500mL摇瓶中取少量293T悬浮细胞，进行镜检和使用细胞计数仪进行细胞计数，其细胞活率在90％可继续传代，然后补加原体积3倍的新鲜培养液但不能超出2/3的500mL摇瓶体积进行传代，重复上述操作培养3代，其细胞活率都稳定在90％，活率能够稳定维持在90％，细胞密度为1.0×10⁶，得含悬浮细胞的混悬液；

S2、将EGFP质粒转染入293T悬浮细胞：

含EGFP质粒的转染混合液的配制：称取EGFP质粒100μg，质量浓度2.5mg/mL的聚醚酰亚胺0.5mL，加磷酸缓冲液定容至10mL，调节pH值至6.0，静置1min，即得。

将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：取步骤S1所得含贴壁细胞的混合液300mL，于1000r/min的条件下离心1min，弃掉全部或9/10上清液，将转染混合液与293T悬浮细胞混合均匀，然后转入500mL摇瓶，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；

S3、转染期间293T悬浮细胞的孵育培养：

将步骤S2所得转染混悬液放在CO₂培养箱中，设置温度25℃，CO₂浓度为1％的条件下静态孵育1h，孵育结束后，加入含有加原体积一半的含有1％～20％牛血清及由青霉素，四环素及氨基糖苷按质量比5：5：2组成的三抗0.8g的新鲜Sigma>293培养液，设置温度为35℃，CO₂浓度为3％，转速为50r/min的条件进行培养，进行孵育培养20h，得含EGFP质粒的混合液；

S4、转染后293T悬浮细胞培养

将步骤S3所得含EGFP质粒的混合液于1000r/min的速度下离心1min，弃掉全部上清液，加入不含血清的Sigma EX-293无血清营养液，设置换液后的培养参数为温度35℃，CO₂浓度3％，转速10r/min的条件培养48h，取出细胞，在荧光显微镜下观察，使用流式细胞仪测定其转染率可达83％。

实施例2一种提高EGFP质粒转染效率的方法

所述提高EGFP质粒转染效率的方法，包括如下步骤：

S1、转染前293T细胞培养：

细胞复苏：取一支来源于ATCC，可传代的冻存的293T细胞，迅速将其放入37℃的水浴中速溶，然后加入到10mL的含质量浓度为0.3g/L谷氨酰胺溶液、摩尔浓度为0.01mol/L的NaHCO₃溶液及质量浓度为0.1mg/mL的硫酸卡那霉素各0.1mL，100000IU青霉素0.1g、pH值为7.0的Sigma>293无血清营养液中，混合均匀，于1500r/min的条件下离心10min，去掉上清液，再加入10mL上述培养液重悬细胞，将重悬好的细胞接入T75的细胞瓶中，再补加10mL上述营养液，放入CO₂细胞培养箱中，于37℃条件下静置培养72h；

T75细胞瓶传代培养：待293T悬浮细胞长满T75方瓶，此时细胞密度为3.0×10⁶，细胞活率达到95％，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液，分装于三个T75规格细胞培养瓶内，每瓶补加含有由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成的杀菌剂1.5g，由青霉素，四环素及氨基糖苷按质量比5：5：2组成的三抗2.0g的新鲜Sigma>293无血清营养液到20mL，在38℃，7％的CO₂浓度的培养箱中培养，培养三代，选择生长状态良好的293T细胞，用吸管吹打培养瓶底制得细胞悬液，分别取样进行镜检和使用细胞计数仪进行细胞计数，取细胞活率在95％的293T悬浮细胞，进行500mL摇瓶培养；向摇瓶中补加含有由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成的杀菌剂1.5g，由青霉素，四环素及氨基糖苷按质量比5：5：2组成的三抗2.0g的Sigma>293无血清营养液至100mL，其细胞活率达90％，细胞形态多为圆形和椭圆形，放在CO₂恒温振荡培养箱中培养，培养条件为：温度：38℃，转速：100r/min，CO₂浓度：7％，经72h培养后，先从500mL摇瓶中取少量293T悬浮细胞，进行镜检和使用细胞计数仪进行细胞计数，其细胞活率在95％可继续传代，然后补加原体积3倍的新鲜培养液但不能超出2/3的500mL摇瓶体积进行传代，重复上述操作培养3代，其细胞活率都稳定在95％，细胞密度为9.0×10⁶，得含悬浮细胞的混悬液；

S2、将EGFP质粒转染入293T悬浮细胞：

含EGFP质粒的转染混合液的配制：称取EGFP质粒1800μg，质量浓度2.5mg/mL的聚醚酰亚胺4.5mL，加磷酸缓冲液定容至90mL，调节pH值至7.4，静置10min，即得。

将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：取步骤S1所得含贴壁细胞的混合液300mL，于1500r/min的条件下离心10min，弃掉全部或9/10上清液，将转染混合液与293T悬浮细胞混合均匀，然后转入500mL摇瓶，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；

S3、转染期间293T悬浮细胞的孵育培养：

将步骤S2所得转染混悬液放在CO₂培养箱中，设置温度37℃，CO₂浓度为5％的条件下静态孵育6h，孵育结束后，加入含有加原体积一半的含有20％牛血清及由青霉素，四环素及氨基糖苷按质量比5：5：2组成的三抗2.0g的新鲜Sigma>293培养液，设置温度为38℃，CO₂浓度为7％，转速为100r/min的条件进行培养，进行孵育培养28h，得含EGFP质粒的混合液；

S4、转染后293T悬浮细胞培养

将步骤S3所得含EGFP质粒的混合液于1500r/min的速度下离心10min，弃掉全部上清液，加入不含血清的Sigma EX-293无血清营养液，设置换液后的培养参数为温度38℃，CO₂浓度7％，转速80r/min的条件培养72h，取出细胞，在荧光显微镜下观察，使用流式细胞仪测定其转染率可达85％。

实施例3一种提高EGFP质粒转染效率的方法

所述提高EGFP质粒转染效率的方法，包括如下步骤：

S1、转染前293T细胞培养：

细胞复苏：取一支来源于ATCC，可传代的冻存的293T细胞，迅速将其放入37℃的水浴中速溶，然后加入到10mL的含质量浓度为0.3g/L谷氨酰胺溶液、摩尔浓度为0.01mol/L的NaHCO₃溶液及质量浓度为0.1mg/mL的硫酸卡那霉素各0.1mL，100000IU青霉素0.1g、pH值为7.0的Sigma>293无血清营养液中，混合均匀，于1300r/min的条件下离心5min，去掉上清液，再加入10mL上述培养液重悬细胞，将重悬好的细胞接入T75的细胞瓶中，再补加10mL上述营养液，放入CO₂细胞培养箱中，于37℃条件下静置培养72h；

T75细胞瓶传代培养：待293T悬浮细胞长满T75方瓶，此时细胞密度为1.5×10⁶，细胞活率达到100％，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液，分装于三个T75规格细胞培养瓶内，每瓶补加含有由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成的杀菌剂1.0g，由青霉素，四环素及氨基糖苷按质量比5：5：2组成的三抗1.3g的新鲜Sigma>293无血清营养液到20mL，在36℃，5％的CO₂浓度的培养箱中培养，培养三代，选择生长状态良好的293T细胞，用吸管吹打培养瓶底制得细胞悬液，分别取样进行镜检和使用细胞计数仪进行细胞计数，取细胞活率在100％的293T悬浮细胞，进行500mL摇瓶培养；向摇瓶中补加含有由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成的杀菌剂1.0g，由青霉素，四环素及氨基糖苷按质量比5：5：2组成的三抗1.3g的Sigma>293无血清营养液至100mL，其细胞活率达100％，细胞形态多为圆形和椭圆形，放在CO₂恒温振荡培养箱中培养，培养条件为：温度：36℃，转速：60r/min，CO₂浓度：5％，经72h培养后，先从500mL摇瓶中取少量293T悬浮细胞，进行镜检和使用细胞计数仪进行细胞计数，培养过程中细胞活率及细胞密度的生长情况见图1，图2，其细胞活率在100％可继续传代，然后补加原体积3倍的新鲜培养液但不能超出2/3的500mL摇瓶体积进行传代，重复上述操作培养3代，其细胞活率都稳定在100％，细胞密度为5.0×10⁶，得含悬浮细胞的混悬液；

S2、将EGFP质粒转染入293T悬浮细胞：

含EGFP质粒的转染混合液的配制：称取EGFP质粒1000μg，质量浓度2.5mg/mL的聚醚酰亚胺2.0mL，加磷酸缓冲液定容至45mL，调节pH值至6.8，静置5min，即得。

将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：取步骤S1所得含贴壁细胞的混合液300mL，于1300r/min的条件下离心5min，弃掉全部或9/10上清液，将转染混合液与293T悬浮细胞混合均匀，然后转入500mL摇瓶，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；

S3、转染期间293T悬浮细胞的孵育培养：

将步骤S2所得转染混悬液放在CO₂培养箱中，设置温度30℃，CO₂浓度为5％的条件下静态孵育3h，孵育结束后，加入含有加原体积一半的含有10％牛血清及由青霉素，四环素及氨基糖苷按质量比5：5：2组成的三抗1.3g的新鲜Sigma>293培养液，设置温度为36℃，CO₂浓度为5％，转速为80r/min的条件进行培养，进行孵育培养24h，得含EGFP质粒的混合液；

S4、转染后293T悬浮细胞培养

将步骤S3所得含EGFP质粒的混合液于1300r/min的速度下离心5min，弃掉全部上清液，加入不含血清的Sigma EX-293无血清营养液，设置换液后的培养参数为温度36℃，CO₂浓度5％，转速50r/min的条件培养60h，取出细胞，在荧光显微镜下观察，使用流式细胞仪测定其转染率可达87％。

对比例1一种提高EGFP质粒转染效率的方法

所述提高EGFP质粒转染效率的方法与实施例3类似；

与实施例3的区别在于，对比例1中步骤S1转染前细胞培养过程中进行T75细胞瓶传代培养时所用的营养液中不添加杀菌剂。

对比例2一种提高EGFP质粒转染效率的方法

所述提高EGFP质粒转染效率的方法与实施例3类似；

与实施例3的区别在于，对比例1中步骤S1转染前细胞培养过程中进行T75细胞瓶传代培养时所用的营养液中不添加三抗。

试验例1本发明试验样品转染效率对比

1.试验样品：EGFP质粒。

2.试验方法：分别以实施例1-3及对比例1-2的方法转染EGFP质粒，并检测质粒转染效率。

3.试验结果：具体试验结果见表1。

表1不同试验样品转染效率对比

试验方法转染效率/％实施例183％实施例285％实施例387％对比例162％对比例265％

由表1可知，利用本发明实施例1-3的方法转染EGFP质粒，转染效率均在80％以上，尤其是实施例3的方法获得的转染效率达87％，转染效率最高，因此，实施例3为本发明的最佳实施例。而对比例1-2中，由于未加杀菌剂，抗生素等物质，导致转染率大幅度降低。

试验例2与常规方法的转染效率对比

1.试验样品：EGFP质粒

2.试验方法：采用实施例3及常规永久转染的方法进行EGFP质粒转染，分别利用荧光显微镜及普通光学显微镜观察质粒转染效果，并使用流式细胞仪检测质粒转染效率。

3.试验结果：荧光显微镜及普通光学显微镜观察到的质粒转染效果见图3，本发明实施例3及常规方法进行质粒转染时的转染效率对比结果见图4，由图3可知，本发明实施例3的转染效果显著高于常规方法。

最后应当说明的是，上文中已经对本技术及具体实施方案作了详尽的描述，但是本发明并不局限于以上描述的具体实施例。因此本领域的任何技术人员在不偏离本发明精神的基础对之作一些改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围，均属于本发明要求保护的范围。