超声微泡造影剂介导EGFP质粒对视网膜母细胞瘤细胞转染效率的实验研究

摘要

视网膜母细胞瘤是最常见的儿童眼内恶性肿瘤。目前的治疗方式有直接摘除眼球及剜出眼眶内容物、化学减容法、激光光凝、温热疗法、冷冻疗法、外照放疗等。基因治疗尚处于研究阶段。微泡造影剂作为一种新型的基因转移载体，在声像图的监控下进行超声辐照，微泡能够在指定部位“爆破”，释放所携带的基因。本文通过体外实验研究超声微泡造影剂携带EGFP基因对视网膜母细胞瘤细胞进行转染的效率及探讨最适转染条件。 全文分为三个部分，依次对微泡造影剂及超声对体外培养的RB细胞生长活性的影响、微泡携带EGFP基因转染RB细胞的最适声强时间条件、以微泡为基因载体与传统转染方法的转染效率对比作了研究。 第一部分检测了微泡造影剂和超声对体外培养的RB细胞生长活性的影响。将培养的RB细胞分为9组，其中5组分别予以超声条件为0．25，0．5，0．75，1．O，1．25W／cm2声强，作用时间均为60s的连续波照射。另4组RB细胞分别予以1％，10％，20％,30％的浓度梯度的微泡造影剂。用O．4％台盼蓝直接染色10min，显微镜观察，计数被染色(死)细胞和拒染(活)细胞。染色结果显示：当超声强度为0．25、0．5及0．75W／cm2，时间60s时，细胞存活率均>95％；当超声强度为1．O及1．25W／cm2，时间60s时，细胞存活率<80％。微泡浓度为l％、10％、20％时，细胞存活率均>90％；微泡浓度为30％时，细胞存活率<80％。在0．25～0．75W／cm2、60s范围内的超声，和低于20％的微泡浓度，对RB细胞的生存无影响。 第二部分在第一部分的基础上，以几种不同的超声条件对RB细胞进行EGFP基因转染。RB细胞分为4组：微泡浓度固定为10％，超声声强分别为0．25，0．5，0．75W／cm2，60s，连续波发射进行转染(共3组)；并增加一组对照组(微泡浓度固定为10％，超声声强1．OW／cm2，60s，连续波发射)。培养24～48h后，在荧光显微镜488nh2下观察EGFP蛋白的表达情况，并以RT-PCR定量检测mRNA表达。结果显示：0．5W／cm2及0．75W／cm2声强处理过的RB细胞可见较多绿色荧光及较亮的电泳条带，且二者表达情况相似。而声强0．25W／cm2及1．OW／em2处理组中RB细胞的转染效率均不如上述两种声强条件。 第三部分将微泡携带基因的转染效率与传统的转染方法进行了对比。RB分为4组，以不同的转染方法进行EGFP基因的转染。①裸质粒转染、②质粒+超声照射转染、③质粒+微泡+超声照射转染、④质粒+脂质体转染。培养24～48h后，在荧光显微镜488nlTl下观察EGFP蛋白的表达情况，并以RT-PCR定量检测mRNA表达。结果显示：第③组(质粒+微泡+超声照射组)和第④组(质粒+脂质体组)可见较多绿色荧光，及较亮的电泳条带；另两组转染效率欠佳。 本实验以超声微泡造影剂为基因载体对体外培养的视网膜母细胞瘤进行了转染，探讨了其对RB细胞生长活性的影响、合适的转染条件，并与传统的转染方法进行了比较。然而RB的基因治疗尚处于起步阶段，真正应用于临床需进一步的研究。 ，

目录

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符号说明

摘要

前言

实验方案图示

第一部分超声波及微泡造影剂对RB细胞生长活性的影响

第二部分超声微泡介导EGFP质粒转染RB细胞最适条件的探讨

第三部分微泡介导转染与传统转染方法的比较

全文结论

参考文献

附 图

文献综述

致 谢

研究生在读期间发表论文及待发表的论文