复配淀粉酶制剂及其在淀粉液化中的应用以及淀粉液化的方法

摘要

本发明涉及淀粉制糖领域，公开了一种复配淀粉酶制剂及其在淀粉液化中的应用以及淀粉液化的方法。该复配淀粉酶制剂包含L型淀粉酶和S型淀粉酶；所述L型淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性，所述S型淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性。本发明淀粉液化的方法，包括向淀粉料液中加入该复配淀粉酶制剂后进行喷射。该复配淀粉酶制剂在高浓度淀粉料液中(相对低的水活度条件下)，既可以快速降低体系黏度，使料液混合均匀、利于泵送，又有较好的热稳定性，可以在较高的温度下喷射液化，使淀粉颗粒完全被破坏，利于液化完全。

说明书

技术领域

本发明涉及淀粉制糖领域，具体涉及一种复配淀粉酶制剂及其在淀粉液化中的应用以及淀粉液化的方法。

背景技术

淀粉糖是以谷物、薯类等富含的淀粉为原料，在酶的催化下，经过液化、糖化等一系列反应，生产的大宗产品。淀粉糖的功能作用很多，既可以作为食品添加剂，也可以作为重要的工业原料，还能经过再次深加工成为低聚糖、维生素、氨基酸等产品，这些产品与百姓生活密切相关，在国民经济中有重要地位。

目前淀粉糖制糖工艺一般采用双酶法，即包括酶液化与糖化工艺。其中液化是淀粉遇水后在加热情况下迅速膨胀，料液黏度增加，淀粉分子间作用力减弱，引起淀粉颗粒解体，此时高温淀粉酶开始作用，快速水解淀粉，不断变成更小的葡萄糖聚合体，最终得到短链糊精。这一过程可以快速降低料液黏度及利于糖化酶进一步水解成单糖。

在传统的淀粉制糖工艺中，不论是购买商品淀粉或是自制淀粉浆，一般采用25％-35％底物含量的淀粉浆底物进行液化。这种典型的制糖工艺效益一般，主要是由于在生产过程中水耗大，实际上酶促反应只需要消耗很少量的水，由于浆料浓度稀，导致下游工艺糖液浓缩过程中不得不蒸发大量的水，耗费大量的能源，导致生产成本增高。而实际上，典型的玉米湿磨工艺的淀粉浆浓度在40％左右，在传统淀粉糖工艺中不得不先稀释后液化；而在一些发酵行业中，补糖的糖液浓度通常需要在40％以上；在果糖生产中，配料起始浓度在35％左右，需要浓缩到45％左右进行异构化，如果可以将配料浓度提高到40-45％，就可以省去异构前的蒸发工序，从而减少固定投资，降低能耗，简化工序。

目前大部分企业意识到高浓度淀粉浆液化具有节能减排，降低成本的优势，逐渐开始对液化工艺进行优化。但高浓度液化工艺中面临诸多挑战，如：随着配料浓度增高，淀粉颗粒的膨胀系数递减，10％的粉浆膨胀系数为15，粉浆浓度从10％增加到45％，膨胀系数降低70％左右，粉浆浓度50-60％的膨胀系数非常低，仅2-3，过低的膨胀系数会导致糊化不彻底，淀粉的晶状结构不能被有效破坏，从而液化不完全。另一个挑战来自底物和酶的扩散，随着粉浆浓度的增加，水分子的迁移率随之降低，淀粉增加浓度从10％到45％，水分子的迁移率降低至少90％，50-60％的淀粉糊中水分子的流动性非常差，而酶促反应的速率与高黏度水溶液中的扩散密切相关，反应系统中水分子的相对低的迁移率会阻碍扩散，淀粉浓度的增加会降低酶和底物的有效扩散，这会对由热稳定的α-淀粉酶催化的淀粉的液化产生负面影响。还有一个挑战来自料液黏度大，随着配料浓度增高，液化过程中的峰值黏度显著增长，当淀粉浓度为50-60％时，浆液可表现出类似固体的行为，不利于生产过程中料液的输送。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的淀粉制糖工艺效益低、高浓度淀粉料液液化中液化不完全并且料液黏度大不利于输送的问题，提供一种复配淀粉酶制剂及其在淀粉液化中的应用以及淀粉液化的方法，该复配淀粉酶制剂在淀粉料液浓度较高时，即相对低的水活度条件下，不仅可以快速降低体系黏度，使料液混合均匀、利于泵送，又有较好的热稳定性，可以在较高的温度下喷射液化，提高淀粉料液的液化程度。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种复配淀粉酶制剂，该复配淀粉酶制剂包含L型淀粉酶和S型淀粉酶；所述L型淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性，所述S型淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性。

本发明第二方面提供所述复配淀粉酶制剂在淀粉液化中的应用。

本发明第三方面提供一种淀粉液化的方法，该方法包括向淀粉料液中加入所述复配淀粉酶制剂后进行喷射。

通过上述技术方案，本发明实现了在高浓度淀粉料液液化的条件下，体系黏度能够迅速降低，有利于料液均匀混合和料液的泵送，并且有利于淀粉酶的扩散，提高酶促反应的速率，使得淀粉料液能够液化完全；本发明技术方案还能够在较高的温度下喷射液化，使淀粉颗粒完全被破坏，从而进一步提高淀粉料液的液化程度。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，术语“液化”是指将碳水化合物分解为小分子多糖的过程。

术语“淀粉酶”是指能水解淀粉分子链中的α-1,4葡萄糖苷键，将淀粉链切断成为短链糊精和少量麦芽糖和葡萄糖，使淀粉黏度迅速下降的一种酶；其中，1g固体酶粉(或1mL液体酶)，于70℃、pH6.0条件下，1min液化1mg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。本发明涉及的淀粉酶包括但不限于具有该活力的淀粉酶。

术语“序列一致性”是指两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列一致性”来描述。当以预设参数使用CLUSTALW算法比对时，具体序列具有与指定参考序列的氨基酸残基至少一定百分比相同的氨基酸残基。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.22:4673-4680。CLUSTALW算法的预设参数为：缺失计数为与参考序列相比不相同的残基。包括在任何末端发生的缺失。例如，缺失C末端的五个氨基酸残基的变体500个氨基酸残基多肽具有相对于亲本多肽的99％(495/500个相同残基×100)的序列一致性百分比。此类变体由语言“具有与亲本至少99％序列一致性的变体”涵盖。

术语“DS”是指以干重计，淀粉料液中的总固体。

术语“DE值”是指干物质中还原糖的含量。

术语“DP”是指不同葡萄糖聚合度的糖组分的重量分布即糖谱分布，DP1表示一糖，DP2表示二糖，DP3表示三糖，DP4表示四糖及以上。

本发明一方面提供一种复配淀粉酶制剂，该复配淀粉酶制剂包含L型淀粉酶和S型淀粉酶；所述L型淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性，所述S型淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性。

在本发明中，所述L型淀粉酶为来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的高温淀粉酶；所述S型淀粉酶为来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的高温淀粉酶。本发明的发明人在研究中发现，将L型淀粉酶和S型淀粉酶制备成复配淀粉酶制剂，并应用到淀粉液化过程中，特别是高浓度淀粉浆液的液化中，相较于二者单独使用能够取得非常好的液化效果，也即，在相对低的水活度条件下，可以快速降黏，使料液混合均匀、利于泵送，又有较好的热稳定性，可以在较高的温度下喷射液化，使淀粉颗粒完全被破坏，利于液化。

在本发明中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为：ANLNGTLMQYFEWYTPNDGQHWKRLQNDSAYLAEHGITAVWIPPAYKGTSQADVGYGAYDLYDLGEFHQKGTVRTKYGTKGELQSAIKSLHSRDINVYGDVVINHKGGADATEDVTAVEVDPADRNRVISGEYLIKAWTHFHFPGRGSTYSDFKWHWYHFDGTDWDESRKLNRIYKFQGKAWDWEVSSENGNYDYLMYADIDYDHPDVVAEIKRWGTWYANELQLDGFRLDAVKHIKFSFLRDWVNHVREKTGKEMFTVAEYWQNDLGALENYLNKTNFNHSVFDVPLHYQFHAASTQGGGYDMRKLLNGTVVSKHPLKSVTFVDNHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGDSQREIPALKHKIEPILKARKQYAYGAQHDYFDHHDIVGWTREGDSSVANSGLAALITDGPGGAKRMYVGRQNAGETWHDITGNRSEPVVINSEGWGEFHVNGGSVSIYVQR*。

SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列为：AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKGTSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVYADVVFDHKGGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDESRKLSRIYKFRGKAWDWEVDTEFGNYDYLMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFSFFPDWLSYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKTDGTMSLFDAPLHNKFYTASKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYNIPSLKSKIDPLLIARRDYAYGTQHDYLDHSDIIGWTREGGTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHAGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTTVSTIARPITTRPWTGEFVRWTEPRLVAWP*。

尽管将L型淀粉酶和S型淀粉酶进行复配使用便能够赋予复配淀粉酶良好的热稳定性以及对淀粉快速减粘的效果，但本发明的发明人进一步发现，当所述S型淀粉酶和所述L型淀粉酶的酶活比例为5：1至40：1；更优选地，所述S型淀粉酶和所述L型淀粉酶的酶活比例为10：1至30：1，进一步优选为15：1至25：1，例如15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1、21：1、22：1、23：1、24：1和25：1时，能够更进一步提高如上的效果。

本发明第二方面还提供所述的复配淀粉酶制剂在淀粉液化中的应用，尤其在高浓淀粉液化中的应用。

本发明中所述高浓淀粉是指固含量在30-50重量％的淀粉料液，进一步指固含量在46-50重量％的淀粉料液，例如，固含量为46重量％、固含量为47重量％、固含量为48重量％、固含量为49重量％、固含量为50重量％的淀粉料液。

本发明第三方面提供一种淀粉液化的方法，该方法包括向淀粉料液中加入所述的复配淀粉酶制剂后进行喷射。

在本发明中，以所述淀粉料液中的干基计，优选地，所述复配淀粉酶制剂的加入量为5-30U/gDS；更优选地，所述复配淀粉酶制剂的加入量为10-25U/gDS，例如10U/gDS、12U/gDS、14U/gDS、15U/gDS、16U/gDS、18U/gDS、20U/gDS、22U/gDS、24U/gDS和25U/gDS。

在本发明中，所述淀粉料液的固含量可以为50重量％及以下的任意值，优选情况下为35-50重量％，更优选情况下为46-50重量％，在喷射液化过程中加入本发明所述的复配淀粉酶制剂能够实现在淀粉浓度高达46-50重量％时仍能有效液化淀粉。

在本发明中，优选地，所述喷射的条件：pH为4-7，喷射温度为105-130℃，喷射时间为5-20min；更优选地，所述喷射的条件：pH为4.5-6，喷射温度为110-120℃，喷射时间为5-10min。

在本发明中，所述方法还包括将喷射后的料液在85-100℃下维持90-130min；优选地，将喷射后的料液在90-95℃下维持100-120min。

以下将通过具体实施例对本发明的优点进行详细描述。

以下实施例中：

所述淀粉料液选用新鲜玉米淀粉料液。

L型淀粉酶购自购自南京百斯杰生物工程有限公司公司。

S型淀粉酶购自购自南京百斯杰生物工程有限公司公司。

杰能科powerliq淀粉酶购自杰能科公司。

诺维信利可莱淀粉酶购自诺维信公司。

其中，干物质含量采用阿贝折光仪测定；还原糖含量采用菲林试剂法测定，具体测试方法为：

(1)斐林试剂的标定：吸取斐林试剂甲、乙液各5ml，置于250ml三角瓶中，加入20ml蒸馏水，并从滴定管中加入0.25％标准葡萄糖液若干毫升，摇匀于电炉上加热至沸，加2滴1％次甲基蓝溶液，继续用0.2％标准的葡萄糖溶液滴定至蓝色消失为终点。记录耗用的0.2％标准葡萄糖溶液体积为A毫升。

(2)定糖预备试验：吸取斐林甲、乙液各5ml，置于250mL三角瓶中，准确加入20mL样品糖液，摇匀于电炉上加热至沸。加2滴1％次甲基蓝溶液，用0.2％标准葡萄糖液滴定至蓝色消失。消耗标准葡萄糖液V0毫升。

(3)样品中还原糖的测定：准确吸取斐林甲、乙液各5mL置于250mL三角瓶中，准确加入20mL样品糖液，补加(A-V0)毫升蒸馏水，并从滴定管中预先加入(V1-1)毫升0.2％标准葡萄糖液。摇匀，于电炉上加热至沸，保持微沸2min，加入2滴1％次甲基蓝溶液，继续用0.2％标准葡萄糖滴定至蓝色消失。记录消耗标准葡萄糖液总体积为B毫升。

其中，

反应产物的糖谱分布(DP)用高效液相色谱进行分析：其中，高效液相色谱为岛津LC-20A，色谱柱为Aminex HPX-87H型柱子，流动相为5mmol/L硫酸，流速为0.6ml/min，检测器为RID-20A。

黏度按如下方法测量：配置新鲜玉米淀粉料液，使用1mol/L的HCl调节pH。称取30g上述料液于流变仪的内杯中，加入酶制剂，混匀后开始测量黏度曲线，由黏度曲线可以读出黏度的峰值和终值。测量仪器为HAAKE^TM>TM>

表1

测量阶段时间(s)温度(℃)剪切速率(S^-1)阶段一303080阶段二1203080阶段三24030-6080阶段四606080阶段五30060-11080阶段六540110-3080

实施例1

配置浓度为48重量％的新鲜玉米淀粉料液，使用1mol/L的HCl调节pH至5.6；称取20g上述料液于反应釜中，加入15U/gDS的复配淀粉酶制剂(S型淀粉酶和L型淀粉酶的酶活比例为20：1)，混合均匀，然后油浴加热至115℃后进行喷射液化，维持时间8min；将喷射结束后的料液置于95℃水浴锅中，维持120min。

测定反应产物的DE值和糖谱分布(DP)，结果如表2所示。

测定pH值为5.6、浓度为48重量％的新鲜玉米淀粉料液与15U/gDS的复配淀粉酶制剂(S型淀粉酶和L型淀粉酶的酶活比例为20：1)混合后的峰值黏度和终值黏度，结果如表3所示。

实施例2

配置浓度为46重量％的新鲜玉米淀粉料液，使用1mol/L的HCl调节pH至4.5；称取20g上述料液于反应釜中，加入10U/gDS的复配淀粉酶制剂(S型淀粉酶和L型淀粉酶的酶活比例为15：1)，混合均匀，然后油浴加热至110℃后进行喷射液化，维持时间5min；将喷射结束后的料液置于90℃水浴锅中，维持115min。

测定反应产物的DE值和糖谱分布(DP)，结果如表2所示。

测定pH值为4.5、浓度为46重量％的新鲜玉米淀粉料液与15U/gDS的复配淀粉酶制剂(S型淀粉酶和L型淀粉酶的酶活比例为15：1)混合后的峰值黏度和终值黏度，结果如表3所示。

实施例3

配置浓度为50重量％的新鲜玉米淀粉料液，使用1mol/L的HCl调节pH至6；称取20g上述料液于反应釜中，加入25U/gDS的复配淀粉酶制剂(S型淀粉酶和L型淀粉酶的酶活比例为25：1)，混合均匀，然后油浴加热至120℃后进行喷射液化，维持时间10min；将喷射结束后的料液置于93℃水浴锅中，维持100min。

测定反应产物的DE值和糖谱分布(DP)，结果如表2所示。

测定pH值为6、浓度为50重量％的新鲜玉米淀粉料液与25U/gDS的复配淀粉酶制剂(S型淀粉酶和L型淀粉酶的酶活比例为25：1)混合后的峰值黏度和终值黏度，结果如表3所示。

实施例4

同实施例1，所不同的是S型淀粉酶和L型淀粉酶的酶活比例为30：1。

测定反应产物的DE值和糖谱分布(DP)，结果如表2所示。

测定pH值为5.6、浓度为48重量％的新鲜玉米淀粉料液与15U/gDS的复配淀粉酶制剂(S型淀粉酶和L型淀粉酶的酶活比例为30：1)混合后的峰值黏度和终值黏度，结果如表3所示。

实施例5

同实施例1，所不同的是S型淀粉酶和L型淀粉酶的酶活比例为10：1。

测定反应产物的DE值和糖谱分布(DP)，结果如表2所示。

测定pH值为5.6、浓度为48重量％的新鲜玉米淀粉料液与15U/gDS的复配淀粉酶制剂(S型淀粉酶和L型淀粉酶的酶活比例为10：1)混合后的峰值黏度和终值黏度，结果如表3所示。

对比例1

同实施例1，所不同的是仅加入15U/gDS的L型淀粉酶。

测定反应产物的DE值和糖谱分布(DP)，结果如表2所示。

测定pH值为5.6、浓度为48重量％的新鲜玉米淀粉料液与15U/gDS的L型淀粉酶混合后的峰值黏度和终值黏度，结果如表3所示。

对比例2

同实施例1，所不同的是仅加入15U/gDS的S型淀粉酶。

测定反应产物的DE值和糖谱分布(DP)，结果如表2所示。

测定pH值为5.6、浓度为48重量％的新鲜玉米淀粉料液与15U/gDS的S型淀粉酶混合后的峰值黏度和终值黏度，结果如表3所示。

对比例3

同实施例1，所不同的是将实施例1中“15U/gDS的复配淀粉酶制剂(S型淀粉酶和L型淀粉酶的酶活比例为20：1)”替换为“15U/gDS的复配淀粉酶制剂(S型淀粉酶和杰能科powerliq淀粉酶的酶活比例为20：1)”。

测定反应产物的DE值和糖谱分布(DP)，结果如表2所示。

测定pH值为5.6、浓度为48重量％的新鲜玉米淀粉料液与15U/gDS的复配淀粉酶制剂(S型淀粉酶和杰能科powerliq淀粉酶的酶活比例为20：1)混合后的峰值黏度和终值黏度，结果如表3所示。

对比例4

同实施例1，所不同的是将实施例1中“15U/gDS的复配淀粉酶制剂(S型淀粉酶和L型淀粉酶的酶活比例为20：1)”替换为“15U/gDS的复配淀粉酶制剂(S型淀粉酶和诺维信利可莱淀粉酶的酶活比例为20：1)”。

测定反应产物的DE值和糖谱分布(DP)，结果如表2所示。

测定pH值为5.6、浓度为48重量％的新鲜玉米淀粉料液与15U/gDS的复配淀粉酶制剂(S型淀粉酶和诺维信利可莱淀粉酶的酶活比例为20：1)混合后的峰值黏度和终值黏度，结果如表3所示。

对比例5

同实施例1，所不同的是将实施例1中“15U/gDS的复配淀粉酶制剂(S型淀粉酶和L型淀粉酶的酶活比例为20：1)”替换为“15U/gDS的复配淀粉酶制剂(杰能科powerliq淀粉酶和诺维信利可莱淀粉酶的酶活比例为20：1)”。

测定反应产物的DE值和糖谱分布(DP)，结果如表2所示。

测定pH值为5.6、浓度为48重量％的新鲜玉米淀粉料液与15U/gDS的复配淀粉酶制剂(杰能科powerliq淀粉酶和诺维信利可莱淀粉酶的酶活比例为20：1)混合后的峰值黏度和终值黏度，结果如表3所示。

表2

表3

实施例编号峰值黏度(mPa·s)终黏度(mPa·s)实施例11080003960实施例21220004380实施例31230004700实施例41110005620实施例51240006250对比例122200012300对比例21260006380对比例31280006860对比例41390008000对比例51320007800

通过表2的结果可以看出，与对比例2-5相比，在高浓度淀粉料液液化的条件下，采用本发明复配酶制剂的实施例1-5中的DE值更高，DP4更低，因而液化程度更高。由表3可以看出，本发明实施例1-5与对比例1-5相比，本发明复合酶制剂与淀粉料液混合后的黏度峰值和黏度终值更低，有利于生产过程中料液的输送。

由表2和表3的结果可以看出，虽然对比例1的DE值高于本发明实施例1-5、DP4低于本发明实施例1-5，有着更好的液化效果，但是其液化过程中的峰值黏度和终黏度均远高于本发明实施例1-5，不利于生产过和中料液的输送。因此，本发明实施例1-5的技术方案在提高高浓度淀粉料液化程度的同时还降低了液化过程中的黏度，利于料液输送，提高了生产效率。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中粮集团有限公司

吉林中粮生化有限公司

南京百斯杰生物工程有限公司

<120> 复配淀粉酶制剂及其在淀粉液化中的应用以及淀粉液化的方法

<130> 快I55909COF

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 483

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<400> 1

Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro

1 5 1015

Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu

202530

Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly

354045

Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu

505560

Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys

65707580

Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn

859095

Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr

100 105 110

Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val

115 120 125

Ile Ser Gly Glu Tyr Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro

130 135 140

Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe

145 150 155 160

Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys

165 170 175

Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn Gly Asn

180 185 190

Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val

195 200 205

Val Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln

210 215 220

Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe

225 230 235 240

Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met

245 250 255

Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn

260 265 270

Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu

275 280 285

His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met

290 295 300

Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser

305 310 315 320

Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu

325 330 335

Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu

340 345 350

Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly

355 360 365

Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile

370 375 380

Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His

385 390 395 400

Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp

405 410 415

Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro

420 425 430

Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr

435 440 445

Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser

450 455 460

Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr

465 470 475 480

Val Gln Arg

<210> 2

<211> 513

<212> PRT

<213> Bacillus stearothermophilus

<400> 2

Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu

1 5 1015

Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn

202530

Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys

354045

Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp

505560

Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr

65707580

Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met

859095

Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly

100 105 110

Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln

115 120 125

Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe

130 135 140

Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His

145 150 155 160

Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr

165 170 175

Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly

180 185 190

Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His Pro Glu

195 200 205

Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn Thr Thr

210 215 220

Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser

225 230 235 240

Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly Lys Pro

245 250 255

Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys Leu His

260 265 270

Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asp Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp Ala Pro

275 280 285

Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala Phe Asp

290 295 300

Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro Thr Leu

305 310 315 320

Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln Ala Leu

325 330 335

Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile

340 345 350

Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr

355 360 365

Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile Asp Pro

370 375 380

Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr

385 390 395 400

Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Gly Thr Glu

405 410 415

Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly

420 425 430

Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val Phe Tyr

435 440 445

Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser Asp Gly

450 455 460

Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp Val Pro

465 470 475 480

Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Arg Pro Ile Thr Thr Arg Pro

485 490 495

Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val Ala Trp

500 505 510

Pro