一种黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因及其应用

摘要

本发明公开了一种黄瓜小热激蛋白Cu‑sHSP基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。还公开了所述黄瓜小热激蛋白Cu‑sHSP基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。以及所述黄瓜小热激蛋白Cu‑sHSP基因在提高植物抵抗高温胁迫方面的应用。

说明书

技术领域

本发明属于小热激蛋白技术领域，具体涉及一种黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因及其应用。

背景技术

黄瓜(Cucumissativus L.)是葫芦科(Cucurbitaceae)重要的蔬菜作物，性喜温，不耐热。然而，随着温室效应的加剧，特别是在华南地区，黄瓜在夏季露地栽培和保护地栽培中时常遭遇高温天气，严重影响了其产量和品质，高温热害已成为限制黄瓜生产的主要因子之一。黄瓜的耐热性研究目前主要集中在生理生化和相关基因的初步定位方面，尚未分离出优质的耐热基因，且分子机理研究尚不深入。

小分子热激蛋白(small heat shock proteins,sHSPs)是植物在面临逆境胁迫时，被激活并且表达增强的一类蛋白，属于热激蛋白(HSP)的一个亚家族。sHSPs在高等植物中极为丰富，具有相对保守的结构域，种类也比其它热激蛋白多；其作为分子伴侣，在植物抵抗高温热害方面起到重要的作用。然而，目前关于小分子热激蛋白在黄瓜耐热性方面的机理研究尚不明晰。因此，开展小分子热激蛋白在黄瓜耐热性方面的研究，不仅可以在遗传水平揭示sHSPs参与黄瓜抵御高温的作用机理，也为黄瓜的耐高温分子辅助育种提供理论支撑，具有重要的应用研究意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因及其编码蛋白。

本发明的目的还在于提供上述黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因的应用。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明中的上述黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因是通过提取黄瓜总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用特异性引物对进行PCR扩增获得。

其中引物对具体为：

Cu-sHSP-F：ATGGAGGAGATCAAGCGTAT；

Cu-sHSP-R：GTGTCCAGAGTTTTTGGAC。

本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：上述黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因在提高植物抵抗高温胁迫方面的应用。

本发明将上述黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因克隆到pCAMBIA1305载体上，获得pCAMBIA1305-Cu-sHSP植物过表达载体。

本发明将上述黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因转入上述过表达载体中通过农杆菌转化使植物获得抵抗高温胁迫能力。

优选的，所述植物为拟南芥。

优选的，所述高温为30～37℃。

结果发现，黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因在拟南芥中的异位过表达转基因植株的耐热性增强，说明黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因在高温胁迫中起到重要作用。因此，证明该基因在提高植物抵抗高温胁迫方面具有重要应用。

本发明具有如下优点：本发明利用特异引物(实施例2)研究了黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因在黄瓜不同组织中的表达，发现黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因在茎和成熟叶片中表达量最高(图2)；黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因在拟南芥中的异位过表达转基因植株的耐热性增强(图3，4)，说明该基因在高温胁迫中起到重要作用。

附图说明

图1是实施例1中Cu-sHSP的扩增结果，其中1-3是Cu-sHSP基因的CDS扩增结果，M是DNA Marker条带；

图2是实施例2中Cu-sHSP基因在不同组织中的表达；

图3是实施例3中Cu-sHSP过表达阳性植株的检测，其中M代表DNA Marker，1-10分别代表T0代转基因植株，PC代表阳性对照，NC代表阴性对照。

图4是实施例4中Cu-sHSP异位过表达拟南芥植株的高温胁迫处理，其中A图代表高温处理前植株的生长情况，B图代表高温胁迫后，恢复到正常温度的植株生长情况，其中OE1是指过表达植株1，OE4是指过表达植株4，其中OE是over expression的缩写。

具体实施方式

下面结合实例具体进一步说明本发明的具体实施方式。

实施例1黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因及其编码蛋白的获取

(1)RNA提取

选用的黄瓜品种为L-9(广东地方常规种，经系谱法分离筛选而来的纯合自交系)为华南型黄瓜纯合自交系。温汤浸种种子4-6小时，然后在28-30℃的培养箱中催芽1天，待种子露白时播种。幼苗长到一叶一心后，对3株幼苗的真叶进行混合取样，加入液氮后用研钵裂解组织和细胞，并迅速转入2.0mL的离心管中，采用植物总RNA提取试剂盒(RNApreppure Tissue Kit，TIANGEN)；用分光光度计检测RNA的浓度，同时琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。接下来，使用大连宝生物公司的逆转录试剂盒(PrimeScript ReverseTranscriptase kit，Takara)，反转录成cDNA。

2)Cu-sHSP基因的扩增

以黄瓜总cDNA为模板，以Cu-sHSP-F(ATGGAGGAGATCAAGCGTAT)和Cu-sHSP-R(GTGTCCAGAGTTTTTGGAC)为正向和反向引物，克隆获得黄瓜Cu-sHSP基因片段。

PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，58℃复性2分钟，72℃延伸45秒，34个循环后72℃8分钟；最终PCR产物进行测序，获得了Cu-sHSP的序列。

其中，图1是Cu-sHSP的扩增结果，其中M代表DNA Marker，2-3扩增条带单一，结果较好。

利用SMART软件对Cu-sHSP蛋白序列结构进行分析发现，该蛋白包括HSP20结构域，从而说明Cu-sHSP为小热激蛋白。

该黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因的核苷酸序列具体如下：

该黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因编码蛋白的氨基酸序列具体如下：

MEEIKRMFEYIFSEKDSSDSGKCPEGKKERYRQNYCRQFPNKDEVRAHSFVPNSPINPETEWLETPHEYFFKLDLAGLKKHEVKLEIDDYNKVLCISRDFGAEREKITGHRSRLKRDKGTVYWRLVDTDNVRAEMDNGVLTVSVPKCVPMMKCEYRKHKARLVQIKSKNSGH*

实施例2Cu-sHSP在不同组织中的表达

1、Cu-sHSP在不同组织中的表达

根据Cu-sHSP的cDNA序列，设计实时定量PCR(qRT-PCR)引物：Cu-sHSP-Q-F:AACCGGTCATAGGAGTCGTC；Cu-sHSP-Q-R:ACACATTTAGGC ACGCTGAC。所用的内参引物为黄瓜的Actin引物，Actin-Q-F:ATGGCCGATGCCGAGGATAT；Actin-Q-R:TAGGAGCATCATCACCAGCAAAA C。

将cDNA模板稀释5倍，配制20μL的反应体系：10μLSYBR Premix Ex Taq II(2×)，0.8μL Forward Primer(Cu-sHSP-Q-F)，0.8μL Reverse Primer(Cu-sHSP-Q-R)，2μLcDNA，0.4μlRox Reference Dye II，6.0μl ddH₂O，然后在荧光定量PCR仪(ABI>

然后在荧光定量PCR仪(ABI Prism 7500HT，Applied Biosystems)上进行扩增反应，以Actin基因作内参，计算基因的相对表达量。每个样品设置3个生物学重复，每个生物学重复包括3个技术重复定量。分别在根、下胚轴、子叶、幼叶、成熟叶、茎、卷须、花芽、花和果实组织中检测Cu-sHSP的表达量。

Cu-sHSP基因在不同组织中的表达如图2中所示，从图中得知黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因在茎和成熟叶片中表达量最高。

实施例3Cu-sHSP过表达载体的构建和过表达植株的检测

以Cu-sHSP基因的cDNA为模板，PCR扩增519bp的编码区，PCR扩增产物回收纯化，pCAMBIA1305质粒用Bgl II酶切回收，CDS片段和线性载体使用In-Fusion^TMAdvantage>

过表达植株检测：

根据过表达载体序列和Cu-sHSP的CDS序列设计特异性引物(1305-Cu-sHSP-F:CGAGCTGTACAGATCTATGGAGGAGATCAAGCGTAT；1305-Cu-sHSP-R:GGCCGCTTTAAGATCTTTAGTGTCCAGAGTTTTTGG)。以转化空白载体为对照，PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，能够扩增出目标条带的为阳性植株。

Cu-sHSP异位过表达拟南芥的T0代转基因植株的检测结果如图3所示，从图3中可知10株转基因植株中，能够扩出目的条带的转基因植株有8株，分别为OE1、OE2、OE3、OE4、OE5、OE6、OE7和OE8，转化率达到80％。证明Cu-sHSP基因异位过表达的转化率较高。

实施例4转基因植株的高温胁迫下的耐热性鉴定

将对照(Arabidopsis thaliana L.Columbia ecotype)和T2转基因纯合株系(T0代拟南芥转基因植株OE1-OE8自交留种而来)的拟南芥种子经过春化处理后点播拟南芥种植专用营养土，并放入人工培养室(16小时光照，22℃)等植株长到4叶时进行定苗，以控制植株的生长密度。待植株长到4-5周时，进行高温胁迫处理(16小时光照，37℃)处理2天，观察对照和转基因植株的表型。然后，在正常生长条件下进行恢复实验处理。最终观察对照和转基因植株的表型。

Cu-sHSP基因异位过表达拟南芥植株的高温胁迫处理结果如图4所示，其中A图代表高温处理前植株的生长情况，B图代表高温胁迫后，恢复到正常温度的植株生长情况。

从图4中可以看出，OE1和OE4这两个过表达植株对于拟南芥阳性植株抵抗高温胁迫的能力明显增强，因此，Cu-sHSP基因异位过表达的拟南芥阳性植株抵抗高温胁迫的能力明显增强，说明Cu-sHSP基因在提高植物耐热性方面具有重要的意义。

以上所述仅是本发明的非限定实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思和不做出创造性劳动的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 一种黄瓜小热激蛋白Cu-sHSP基因及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 519

<212> DNA

<213> 小分子热激蛋白(small heat shock proteins)

<400> 1

atggaggaga tcaagcgtat gttcgaatac atcttttctg aaaaggattc gtccgacagc 60

ggaaagtgcc ctgaaggtaa gaaagaacgc taccgccaaa attattgcag gcaatttccc 120

aataaagatg aggttcgagc ccattccttt gttccaaatt cccctataaa ccctgagact 180

gaatggcttg aaacccctca tgaatacttt ttcaagttag atcttgccgg attgaaaaag 240

catgaagtaa aattggagat tgatgactac aataaagttc tatgtatcag cagggatttt 300

ggggctgaga gggagaagat aaccggtcat aggagtcgtc tgaaacgaga taaaggaacg 360

gtctactggc gtttggtgga taccgataat gtgagagcag aaatggataa cggagtattg 420

accgtcagcg tgcctaaatg tgtcccaatg atgaaatgcg agtacaggaa gcacaaggcc 480

agacttgtcc aaatcaagtc caaaaactct ggacactaa 519

<210> 2

<211> 172

<212> PRT

<213> 小分子热激蛋白(small heat shock proteins)

<400> 2

Met Glu Glu Ile Lys Arg Met Phe Glu Tyr Ile Phe Ser Glu Lys Asp

1 5 1015

Ser Ser Asp Ser Gly Lys Cys Pro Glu Gly Lys Lys Glu Arg Tyr Arg

202530

Gln Asn Tyr Cys Arg Gln Phe Pro Asn Lys Asp Glu Val Arg Ala His

354045

Ser Phe Val Pro Asn Ser Pro Ile Asn Pro Glu Thr Glu Trp Leu Glu

505560

Thr Pro His Glu Tyr Phe Phe Lys Leu Asp Leu Ala Gly Leu Lys Lys

65707580

His Glu Val Lys Leu Glu Ile Asp Asp Tyr Asn Lys Val Leu Cys Ile

859095

Ser Arg Asp Phe Gly Ala Glu Arg Glu Lys Ile Thr Gly His Arg Ser

100 105 110

Arg Leu Lys Arg Asp Lys Gly Thr Val Tyr Trp Arg Leu Val Asp Thr

115 120 125

Asp Asn Val Arg Ala Glu Met Asp Asn Gly Val Leu Thr Val Ser Val

130 135 140

Pro Lys Cys Val Pro Met Met Lys Cys Glu Tyr Arg Lys His Lys Ala

145 150 155 160

Arg Leu Val Gln Ile Lys Ser Lys Asn Ser Gly His

165 170