能够促进枯草芽孢杆菌产芽孢的培养基及其应用

摘要

本发明涉及微生物工程领域，公开了能够促进枯草芽孢杆菌产芽孢的培养基及其应用。本发明提供的培养基含有0.3‑0.8重量％的酵母粉、0.3‑0.8重量％的玉米浆、0.3‑0.8重量％的糖蜜、1.5‑2.5重量％的玉米粉、2‑3重量％的豆粕和0.008‑0.02重量％的硫酸锰，pH7‑7.5。本发明还提供了上述培养基在培养枯草芽孢杆菌或制备动物饲料中的用途。本发明还提供了制备动物饲料的方法，包括使用所述培养基对枯草芽孢杆菌进行液体培养，获得的培养液进行喷雾干燥，并将得到的干燥物与基础营养物质混合。本发明能够有效促进枯草芽孢杆菌产芽孢。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物工程领域，具体涉及能够促进枯草芽孢杆菌产芽孢的培养基及其应用。

背景技术

随着发酵饲料应用范围的普及，发酵饲料产量的提升迫在眉睫，而液态种子液的制备是制约产量的一个关键因素；液态种子液制备工艺复杂、保存周期短；因此固体菌剂应用于发酵饲料，是一个突破性的进展，能解决设备、技术、人力等方向的限制，是稳定和提升产品质量和提高产量的重要因素。

枯草芽孢杆菌菌体能自身合成消化性酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等；全日粮在发酵与储存期间，产生的酶系能使纤维、淀粉、蛋白质降解为更易被动物吸收利用的小分子物质，提高饲料的转化率。枯草芽孢杆菌在消化道中与内源酶共同发挥作用，提高饲料消化率。在动物肠道内生长繁殖，能产生多种营养物质如维生素、氨基酸、有机酸、促生长因子等，参与动物机体的新陈代谢，为动物机体提供营养物质。

然而，往饲料中添加以营养体存在的枯草芽孢杆菌不利于维持枯草芽孢杆菌的活菌数，随着时间的推移，饲料的枯草芽孢杆菌活菌数下降，无法有效提高饲料的消化率从而降低饲养动物的淘汰率，而以芽孢形式添加则不存在该问题。因此，尽可能促使枯草芽孢杆菌产芽孢具有特别重大的实用意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的枯草芽孢杆菌产芽孢数较低的问题，提供能够促进枯草芽孢杆菌产芽孢的培养基及其应用。

为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种能够促进枯草芽孢杆菌产芽孢的培养基，该培养基含有0.3-0.8重量％的酵母粉、0.3-0.8重量％的玉米浆、0.3-0.8重量％的糖蜜、1.5-2.5重量％的玉米粉、2-3重量％的豆粕和0.008-0.02重量％的硫酸锰，pH7-7.5。

本发明第二方面提供了上述培养基在培养枯草芽孢杆菌或制备动物饲料中的用途。

本发明第三方面提供了培养枯草芽孢杆菌的方法，该方法包括：采用上述培养基对枯草芽孢杆菌进行液体培养。

本发明第四方面提供了一种制备动物饲料的方法，该方法包括按照上述方法对枯草芽孢杆菌进行液体培养，获得的培养液进行喷雾干燥，并将得到的干燥物与基础营养物质混合。

通过上述技术方案，本发明能够有效促进枯草芽孢杆菌产芽孢，从而使得饲料的消化率得到显著提高，降低了饲养动物的淘汰率。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，培养基的pH均指初始pH值，也即灭菌前的pH值，其它成分亦然，均为配制时(灭菌前)的用量；使用的“CFU”为菌落形成单位，可以通过平板菌落计数法测得；芽孢数量按照GB/T 26428-2010饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测方法测得。

本发明提供的能够促进枯草芽孢杆菌产芽孢的培养基含有0.3-0.8重量％的酵母粉、0.3-0.8重量％的玉米浆、0.3-0.8重量％的糖蜜、1.5-2.5重量％的玉米粉、2-3重量％的豆粕和0.008-0.02重量％的硫酸锰，pH 7-7.5。

根据本发明优选的实施方式，所述培养基含有0.45-0.55重量％的酵母粉、0.45-0.55重量％的玉米浆、0.45-0.55重量％的糖蜜、1.9-2.1重量％的玉米粉、2.4-2.6重量％的豆粕和0.009-0.012重量％的硫酸锰，pH 7-7.4。

本发明的培养基一般含有水，含量可根据需要进行选择，例如，可以为92-96重量％。本发明的培养基含有上述成分或由以上成分和水组成。其中，酵母粉、玉米浆、糖蜜、玉米粉和豆粕均为常规的用来配制微生物的培养基的物质，可以通过商购获得。

本发明还提供了本发明的上述培养基在培养枯草芽孢杆菌或制备动物饲料中的用途。

本发明提供的培养枯草芽孢杆菌的方法包括：采用上述培养基对枯草芽孢杆菌进行液体培养。

培养时，对枯草芽孢杆菌的接种量没有特别的要求，然而，在本发明的优选实施方式中，相对于每毫升的培养基，所述枯草芽孢杆菌的接种量为1-2CFU。

本发明中，所述枯草芽孢杆菌可以为本领域常用的各种枯草芽孢杆菌，可以通过商购获得。

本发明中，对液体培养的条件没有特别的要求，可以为常规的培养枯草芽孢杆菌的条件。优选情况下，液体培养的条件包括：温度为28-32℃，时间为12-20h，搅拌速率为110-130rpm。

本发明中，在采用本发明的培养基对枯草芽孢杆菌进行液体培养之前，还可以对枯草芽孢杆菌进行活化，活化可以按照常规的活化方式进行。例如，可以采用含蛋白胨、酵母粉、氯化钠和葡萄糖的培养基进行活化，活化可以采用一级活化的方式，也可以采用二级活化的方式。在此不再详述。

本发明提供的制备动物饲料(如禽类饲料，特别是肉鸡饲料)的方法包括按照上述方法对枯草芽孢杆菌进行液体培养，获得的培养液进行喷雾干燥，并将得到的干燥物与基础营养物质混合。

根据本发明，所述喷雾干燥一般在喷雾干燥器中进行。喷雾干燥器的进口温度可以为150-200℃，出口温度可以为100-120℃。喷雾干燥持续的时间可以为10-60s。喷雾干燥所使用的载体可以为常用的各种载体，一般为不影响动物饲料营养和口感的载体，优选为玉米粉、玉米皮、玉米芯和水溶性淀粉中的至少一种。喷雾干燥时所使用的载体与待干燥物料(培养液)的重量比为(0.5-1.5):1。

根据本发明的优选实施方式，相对于每克的基础营养物质，所述干燥物以枯草芽孢杆菌的芽孢数量计的用量为10¹²-10¹⁵CFU。

根据本发明，所述基础营养物质可以为常规的用于配制动物饲料的营养物质，包括蛋白质、脂类、碳水化合物、维生素和矿物质等。基础营养物质的含量可以根据动物的营养需求进行适当的选择，优选情况下，以所述动物饲料的总重量为基准，蛋白质的含量为20-55重量％、脂类的含量为15-20重量％、碳水化合物的含量为20-35重量％、维生素的含量为1-1.5重量％且矿物质的含量为0.2-3重量％。基础营养物质可以由常规的用于配制动物饲料的原料提供，例如，所述基础营养物质可以由动物性饲料原料(如鱼粉、肝脏粉、虾粉、虾壳粉、蟹粉、蟹壳粉、鸡肉粉、血粉、蚕蛹等)，植物性饲料原料(如豆粕、花生粕、面粉、棉粕、菜粕、单细胞蛋白(酵母)、酒糟粕、玉米蛋白粉等)，油脂原料(如鱼油、磷脂油、豆油、乌贼膏、玉米油、棕榈油、亚麻籽油等)，维生素(如V_C和V_E等)等配合提供，例如，由“鱼粉、大豆粉、花生粕、酵母、大豆卵磷脂、虾壳粉、小麦粉、种子脂肪、乳酸钙和磷酸二氢钙”的混合物提供，采用何种配比进行混合得到所述混合物是本领域技术人员能够很容易确定的，在此不再赘述。

一般地，所述动物饲料含有一定量的水，例如，动物饲料中水分含量一般为8-12重量％。此外，为了进一步改善动物的肉质并促进培养，所述动物饲料中还可以含有添加剂，如诱食剂、免疫增强剂、生长促进剂、耐高温酶制剂、抗氧化剂等。添加剂的含量通常为5-10重量％。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，枯草芽孢杆菌获自安徽农业大学生命科学学院，编号为951NA4；肉鸡的日粮购自中国农业大学动物试验基地(蛋白质的含量为41重量％、脂类的含量为20重量％、碳水化合物的含量为35重量％、维生素的含量为1重量％且矿物质的含量为3重量％)；出芽率(％)＝芽孢数量/终点菌落数×100％，其中芽孢数量通过GB/T 26428-2010饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测方法测得。

实施例1

(1)按照表1的培养基和条件，使用250ml的烧瓶对枯草芽孢杆菌进行一级摇瓶和二级摇瓶(活化)，然后，使用有效容积为400L的扩培罐对枯草芽孢杆菌扩培。

表1

(2)然后将扩培罐中的培养液(出芽率等表征结果见表1)进行喷雾干燥，条件如下：

喷雾载体：玉米芯，与培养液的重量比为1:1

进口温度：150℃

出口温度：100℃

持续时间：10s

(3)在肉鸡的日粮中添加步骤(2)得到的干燥物，按照每克日粮添加5×10¹⁴CFU的菌的量添加，得到饲料1。

实施例2

按照实施例1的方法制备饲料，不同的是，按照每克日粮添加10¹⁴CFU的菌的量添加干燥物，得到饲料2。

实施例3

按照实施例1的方法制备饲料，不同的是，喷雾干燥的条件如下：

喷雾载体：玉米粉，与培养液的重量比为1:1

进口温度：200℃

出口温度：120℃

持续时间：10s

并按照每克日粮添加2×10¹⁴CFU的菌的量添加干燥物，得到饲料3。

实施例4

按照实施例1的方法制备饲料，不同的是，喷雾干燥的条件如下：

喷雾载体：玉米芯，与培养液的重量比为1:1

进口温度：150℃

出口温度：100℃

持续时间：60s

并按照每克日粮添加4×10¹⁴CFU的菌的量添加干燥物，得到饲料4。

实施例5

按照实施例1的方法制备饲料，不同的是，扩培罐中的培养基中各个成分的含量如下所示：0.45重量％的酵母粉、0.55重量％的玉米浆、0.45重量％的糖蜜、1.9重量％的玉米粉、2.6重量％的豆粕和0.009重量％的硫酸锰，余量为水，按照每克日粮添加10¹⁵CFU的菌的量添加干燥物，得到饲料5。其中，扩培得到的培养液的出芽率等表征结果见表2。

实施例6

按照实施例1的方法制备饲料，不同的是，扩培罐中的培养基中各个成分的含量如下所示：0.55重量％的酵母粉、0.45重量％的玉米浆、0.55重量％的糖蜜、2.1重量％的玉米粉、2.4重量％的豆粕和0.012重量％的硫酸锰，余量为水，按照每克日粮添加10¹⁴CFU的菌的量添加干燥物，得到饲料6。其中，扩培得到的培养液的出芽率等表征结果见表2。

对比例1

按照实施例1的方法制备饲料，不同的是，扩培罐中的培养基被替换为成分如下的培养基：玉米浆1.5重量％、糖蜜0.5重量％、葡萄糖0.5重量％，余量为水，得到饲料D1。其中，扩培得到的培养液的出芽率等表征结果见表2。

对比例2

按照实施例1的方法制备饲料，不同的是，扩培所使用的培养基中，用“硫酸锌”代替“硫酸锰”，得到饲料D2。其中，扩培得到的培养液的出芽率等表征结果见表2。

对比例3

按照实施例1的方法制备饲料，不同的是，酵母粉的用量为2重量％，玉米粉的用量为0.5重量％，得到饲料D3。其中，扩培得到的培养液的出芽率等表征结果见表2。

表2

终点OD(稀释100倍)终点菌落数(CFU/ml)出芽率(％)实施例50.7311.3×10¹⁶98实施例60.7421.5×10¹⁶98.6对比例10.4505.5×10¹¹0对比例20.5267.0×10¹²60.8对比例30.6202.3×10¹³82.5

通过表1和2的结果可以看出，采用本发明的培养基制备枯草芽孢杆菌培养液的实施例具有提高出芽率的明显更好的效果。

测试例1

(1)将上述实施例和对比例制得的饲料放置30天后采用平板菌落计数法测定枯草芽孢杆菌的含量，结果如表3所示。

(2)使用上述实施例和对比例制得的饲料分别饲养肉鸡雏鸡(每组100只，鸡龄为5天，平均体重为100g)，每天投喂三次，投喂42天后称重，并计算料肉比(饲料投喂重量和肉鸡的体重之间的比值)和淘汰率(死亡数和病鸡数之和占原始雏鸡数量的百分比)。使用未添加干燥物(枯草芽孢杆菌)的日粮作为对照。结果如表3所示。

表3

保存30天后的菌数(CFU/g)平均体重(kg)料肉比淘汰率(％)对照组—2.202.125.0饲料1基本不变2.651.710.5饲料2基本不变2.551.720.6饲料3基本不变2.601.730.6饲料4基本不变2.501.7350.75饲料5基本不变2.621.700.65饲料6基本不变2.711.680.58饲料D1减少至5.0×10⁶2.401.802.2饲料D2减少至7.2×10¹⁰2.451.782.0饲料D3减少至6.5×10¹¹2.381.862.3

表3中，基本不变是指十进制下的数量级维持不变。从表3的结果可以看出，使用本发明的培养基制备饲料可以有效提高肉鸡的体重，并降低淘汰率。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。