一种基于拉曼-荧光双模式探针的活细胞内细胞色素c的检测方法

摘要

本发明公开了一种基于拉曼‑荧光双模式探针的活细胞内细胞色素c的检测方法，所述检测方法是基于表面增强拉曼散射和荧光共振能量转移的“开‑关”转换，通过在金三角片(AuNTs)上组装细胞色素c(Cyt c)的适配体及其部分互补的修饰荧光团Cy5的DNA构建的纳米传感器实现双重信号的检测。本发明方法能够同时检测用拉曼和荧光两种信号同时检测活细胞内Cyt c，且检测特异性强、灵敏度高、准确度高，与ELISA相比误差小于5％。

说明书

技术领域

本发明涉及纳米材料和生命科学领域，尤其是涉及一种基于拉曼-荧光双模式探针的活细胞内细胞色素c(Cyt c)的定量检测方法。

背景技术

细胞凋亡是程序性细胞死亡的过程，是一种复杂且高度调节的过程，对细胞生长和增殖具有显着影响。作为早期凋亡的重要生物标志物，细胞色素c(Cyt c)被认为是内在凋亡途径的关键组分，并且通常表明细胞凋亡中的无回归点。在正常条件下，Cyt c存在于细胞中线粒体膜的顶部，充当Cyt c还原酶和Cyt c氧化酶之间的线粒体膜空间中的电子载体。当细胞处于病理条件下时，线粒体膜孔开放，Cyt c从线粒体释放到细胞质中，激活caspase凋亡蛋白家族，扩增死亡受体途径，导致细胞凋亡或坏死。因此，细胞质中Cyt c含量的增加可被视为早期细胞凋亡的信号。许多物质都会引起细胞凋亡，包括食物中的许多毒素。研究毒素对细胞的影响主要涉及细胞毒理学。在毒理学实验中，大多数细胞状态的研究需要荧光染色，从而抑制了细胞的实时观察。此外，它无法精细地观察细胞内物质的变化。因此，开发一种不需要染色并且可以实时监测细胞内物质和细胞状态变化的毒理学方法具有重要的研究意义。

目前已经开发了多种用于Cyt c检测的方法，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹分析、高效液相色谱(HPLC)、分光光度法和流式细胞术。虽然已有的方法具有高灵敏度，但大多数这些方法不适用于检测活细胞中的Cyt c，因为它们通常需要裂解或固定细胞样品。因此，出现了Cyt c的无损检测方法，但这些方法中的大多数都集中在活细胞中Cytc的定性荧光成像上。活细胞中Cyt c的定量分析仍然是一个挑战。更准确的定量和原位实时追踪活细胞中Cyt c可以提供评估与死亡，疾病进展，治疗和线粒体损伤相关的过程所需的更好的实时信息。

拉曼光谱是可以标记特定的化学基团的指纹光谱，因此它已经成为一种常用的化学成分分析手段。利用拉曼光谱分析样品不需要特殊的制备步骤，并具备无损测量的优势。相比传统的红外光谱检测手段易受到水溶液的背景干扰，而水的拉曼光谱很弱，因此，对于生物样品来说，拉曼光谱是一种很理想的分析手段。然而，多数样品，特别是生物样品，由于其较弱的拉曼散射强度，在一定程度上阻碍了这一技术在多个领域的应用。由此，表面增强拉曼光谱(surface enhanced Raman spectroscopy,SERS)技术应运而生。其原理是基于被测分子吸附在某些经特殊处理、具有纳米结构的金属表面具有极强拉曼散射增强效应的分子振动光谱技术。因SERS技术具有前处理简单、操作简便、检测时间短、灵敏度高等优点，在生命科学、食品安全检测等领域具有良好的应用前景。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种基于拉曼-荧光双模式探针的活细胞内Cyt c的检测方法。本发明方法能够同时检测用拉曼和荧光两种信号同时检测活细胞内Cyt c，且检测特异性强、灵敏度高、准确度高，与ELISA相比误差小于5％。

本发明的技术方案如下：

一种基于拉曼-荧光双模式探针的活细胞内细胞色素c的检测方法，所述检测方法是基于表面增强拉曼散射(SERS)和荧光共振能量转移(FRET)的“开-关”转换，通过在金三角片(AuNTs)上组装Cyt c的适配体及其部分互补的修饰荧光团Cy5的DNA构建的纳米传感器实现双重信号的检测。

所述拉曼-荧光双模式探针是由AuNTs修饰Cyt c的适配体、与其适配体部分互补配对的修饰Cy5的互补链制得。

所述拉曼-荧光双模式探针的制备方法包括如下步骤：

(1)制备金种子：将50μL 25mM的HAuCl₄溶液加入到4.7mL的0.1M>4溶液，溶液由淡黄色变成橘色后在室温下静置2h以消耗过量的NaBH₄，备用；

(2)制备AuNTs：将制备的种子用0.1M CTAC溶液稀释10倍后，接着制备两种生长液：

(2a)将1.6mL 0.1M CTAC溶液加入8mL超纯水中，再加入40μL 50mM HAuCl₄和15μL10mM>

(2b)将500μL 50mM HAuCl4加入到40mL 0.05M CTAC中，然后加入300μL 10mMNaI，制得生长液B；

(2c)将40μL与400μL的0.1M抗环血酸(AA)溶液分别加入到生长液A与B中，并且搅拌至两种溶液由浅黄色至完全透明，然后将100μL稀释的种子加入到生长液A中，搅拌不超过5s后，立即将3.2mL该溶液加入到生长液B中并搅拌5s，最后将生长液B在室温下静置1h，1h后继续像生长液B中添加5mL 25％CTAC溶液，过夜后吸除上清，将沉淀重悬在5mL超纯水中；

(3)制备拉曼-荧光双模式探针：

(3a)在重悬的AuNTs中加入SH-PEG-COOH溶液并且不断搅拌1h，以3000rpm的转速离心10min，将DNA溶液置于高于Tm温度的水浴中5min；

(3b)然后将Cyt c适配体DNA1溶液加入到AuNTs中，使DNA1终浓度为1μM，混合液置于摇床中(120rpm,37℃)孵育过夜后，3000rpm 15min离心除去过量反应物，重悬到原体积；

(3c)再加入Cyt c适配体互补链DNA2，使DNA2终浓度为500nM，混合均匀后置于摇床(120rpm,37℃)并孵育过夜；

(3d)离心除去未反应的DNA，重悬后，再加入20μL细胞膜穿透肽(TAT)，37℃振荡过夜孵育，最后以3000rpm的转速离心两次，每次10min，重悬，备用。

所述的Cyt c的适配体DNA1序列为：

5’-SH-AGTGTGAAATATCTAAACTAAATGTGGAGGGTGGGACGGGAAGAAGTTTATTTTTCACACT-3’；

互补链DNA2序列为：5’-ATATTTCACACT-Cy5-3’。

所述的活细胞是人的肝癌细胞HepG2。

所述检测方法中拉曼检测包括如下步骤：待细胞生长到对数生长期后，将细胞按80000个/mL的密度接种350μL到无菌石英片上，细胞培养至贴壁后，吸出旧培养基，加入混匀探针的基本培养基2mL，与细胞共培养24h，吸出含有探针的培养基并用PBS清洗三次，然后加入混有相同浓度的AFB1的基本培养基，分别共培养0、0.25、0.5、0.75、1、1.5和2h，马上进行SERS光谱检测和SERS成像。

所述检测方法中荧光检测包括如下步骤：待细胞生长到对数生长期后，将细胞按40000个/mL的密度接种500μL到激光共聚焦专用小皿上，细胞培养至贴壁后，吸出旧培养基，加入混匀组装体的基本培养基500μL，与细胞共培养24h，吸出含有探针的培养基并用PBS清洗三次，然后加入混有相同浓度的AFB1的基本培养基，分别共培养0、0.25、0.5、0.75、1、1.5和2h；然后吸出含有AFB1的培养基，用PBS清洗三次，并用DAPI染色3min，3min后清洗DAPI，并马上进行荧光成像。

本发明有益的技术效果在于：

(1)本发明拉曼-荧光双模式探针的制备简单便捷。

(2)本发明结合了SERS灵敏度高和荧光直观可视的优点，第一次用两种信号实现活细胞中Cyt c的定量检测。

(3)本发明方法简单易行、便捷高效，结果准确可靠，定量结果与ELISA相比误差小于5％。

(4)本发明拉曼-荧光双模式探针是基于SERS和FRET的“开-关”转换。通过在AuNTs上组装与Cyt c具有高亲和力和强特异性的适配体及其部分互补的修饰荧光团Cy5的DNA构建的纳米传感器实现双重信号的检测。

(5)本发明AuNTs产生良好的光学信号，具有显著的拉曼增强和荧光淬灭效应。当细胞质中没有游离的Cyt c时，AuNT作为拉曼增强基底增强了互补链上Cy5的拉曼信号，而使其荧光淬灭；当细胞被诱导至开始凋亡时，细胞质中会产生游离的Cyt c，就会触发传感器，导致SERS强度的减弱和荧光信号的恢复。利用显微共聚焦拉曼光谱仪和激光共聚焦显微镜对细胞进行光谱检测和成像。实验结果表明此探针不仅对Cyt c有优异的选择性和灵敏度，可以实现对活细胞内Cyt c易位事件的实时监测，还可精确定量胞质中Cyt c的含量，且定量结果与ELISA相比误差小于5％，满足活细胞中Cyt c准确定量检测的要求。

(6)和已有的方法相比，本方法由于利用了两种信号进行检测，方法的灵敏度和检测限都有一定程度的优化。

(7)由于细胞体系的复杂性，以及细胞培养基基质的影响等的原因，已有的方法未提及到活细胞内Cyt c的定量检测，而本方法可以达到，且准确性高。

(8)本方法在不同的细胞系内具有良好的通用性。

附图说明

图1：AuNTs的紫外-可见吸收光谱图；

图2：AuNTs的透射电镜(TEM)图；

图3：Cyt c适配体浓度的优化；

图4：Cyt c适配体互补链浓度的优化；

图5：拉曼-荧光双模式探针的稳定性；

图6：拉曼-荧光双模式探针用于体外Cyt c拉曼检测；

图7：在1366cm^-1处的SERS强度的线性关系；

图8：拉曼-荧光双模式探针用于体外Cyt c荧光检测；

图:9：在670nm处的荧光强度的线性关系；

图10：拉曼-荧光双模式探针拉曼信号的选择性；

图11：拉曼-荧光双模式探针荧光信号的选择性；

图12：不同浓度金含量(0、25、50、100、200和500μM)的拉曼-荧光双模式探针与HepG2细胞共培养24h的存活率；

图13：不同浓度的AFB1(0、0.5、10、50、100和200μM)侵染HepG2细胞2h的细胞存活率；

图14：来自相应细胞的血浆提取物的蛋白质印迹分析；

图15：拉曼-荧光双模式探针用于活细胞中的Cyt c SERS检测；

图16：SERS强度在1366cm^-1处的线性关系；

图17：共聚焦和SERS成像；

图18：共焦强度在670nm处的线性关系；

图19：ELISA四参数逻辑对应于不同的Cyt c浓度的拟合曲线；

图20：拉曼-荧光双模式探针用于实际样品中中的Cyt c的拉曼检测；

图21：拉曼-荧光双模式探针用于实际样品中中的Cyt c的共聚焦成像；

图22：拉曼-荧光双模式探针用于HepG2、HeLa和A549不同细胞系的Cyt c的拉曼检测；

图23：拉曼-荧光双模式探针用于HepG2、HeLa和A549不同细胞系的Cyt c的共聚焦成像。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1

金种子的合成路线如下：

将50μL 25mM的HAuCl₄溶液加入到4.7mL的0.1M>4溶液，溶液由淡黄色变成橘色后在室温下静置2h以消耗过量的NaBH₄，备用。

实施例2

AuNTs的合成路线如下：

将制备的种子用0.1M CTAC溶液稀释10倍后，接着制备两种生长液：(A)将1.6mL0.1M CTAC溶液加入8mL超纯水中，再加入40μL 50mM HAuCl₄和15μL>4加入到40mL>III还原为Au^I。然后将100μL稀释的种子加入到生长液A中，搅拌不超过5s后，立即将3.2mL该溶液加入到生长液B中并搅拌5s。最后将生长液B在室温下静置1h。1h后继续像生长液B中添加5mL>

实施例3

拉曼-荧光双模式探针的制备：

在重悬的AuNTs中加入SH-PEG-COOH溶液并且不断搅拌1h，以3000rpm的转速离心10min去除多余未反应的试剂。将DNA溶液置于高于Tm温度的水浴中5min以活化DNA。然后将Cyt c适配体DNA1溶液加入到AuNTs中，使DNA1终浓度为100、250、500、800、1000和1200nM(图3)。众所周知，吸光度降低的强度在一定程度上代表了NP和DNA之间的亲和力。DNA水溶液具有典型的吸收带(约260nm)，这个值的下降可以用来证明纳米颗粒被DNA修饰。如图所示，随着DNA1浓度的增加，ΔA260显着增加。当浓度达到1000nM时，ΔA260几乎不变。因此DNA1终浓度的最优浓度为1000nM。混合液置于摇床中(120rpm，37℃)孵育过夜后，3000rpm15min离心除去过量反应物，重悬到原体积。再加入Cyt c适配体互补链DNA2，使DNA2终浓度为50、100、200、500和1000nM(图4)。随着DNA2浓度的增加，Cy5 1366cm^-1处的特征峰强度不断增加，当DNA2的浓度为500nM时，特征峰强度大致保持不变，推测DNA的连接已经饱和，选择DNA2终浓度的最优浓度为500nM。混合均匀后置于摇床(120rpm，37℃)并孵育过夜。离心除去未反应的DNA，重悬后，再加入20μL>

实施例4

拉曼-荧光双模式探针的稳定性实验：

将拉曼-荧光双模式探针分别加入Buffer和培养基中孵育0、12、24和48h，检测Cy5SERS信号的变化。培养基中的盐离子容易引起纳米材料的聚集，造成SERS效应的增强。因此，培养基中Cy5的SERS信号越接近Buffer中的信号，说明AuNTs的稳定性越好，如图5所示。

实施例5

利用拉曼-荧光双模式探针体外检测Cyt c：

在拉曼-荧光双模式探针溶液中加入不同浓度的Cyt c标准品，孵育2h后分别测测定SERS(图6、7)和荧光光谱(图8、9)。随着Cyt c浓度的增加，1366cm^-1处SERS强度减弱的同时，荧光强度不断增强。在200～15000nM的浓度范围内，观察到1366cm^-1处的谱带强度和荧光强度都与Cyt>-1处的SERS强度和670nm处的荧光强度。结果显示，含有10μM>

实施例6

拉曼-荧光双模式探针的细胞毒性检测：

采用CCK-8法检测组装体的细胞毒性。将对数期细胞消化并制备成细胞悬液，以每孔100μL以5000个细胞/mL的密度接种到96孔板中。培养24h后，加入20μL含有不同金含量的探针，使培养基中的最终金浓度分别为0μM，20μM，50μM，100μM，200μM和500μM，然后在培养箱中孵育24h。24h后，加入10μL的CCK-8试剂，继续培养4h。最后，用酶标仪测量450nm激发波长处的吸光度。利用下述公式计算细胞相对存活率：细胞相对存活率(RGR)＝(实验组吸光值—CCK8本底)/(对照组实验值—CCK8本底)×100％(图12)。当金含量低于100μM时，探针对细胞存活率无明显影响，但当金含量为200μM时，细胞的存活率明显降低，可能是材料对细胞产生了较大的毒性作用。为了使探针浓度最高达到最大的SERS增强效应且不影响细胞的正常生长增殖，故选择的最适金含量为100μM。

实施例7

AFB1的细胞毒性检测：

采用CCK-8法确定AFB1与细胞共培养的最佳时间。将生长对数期的细胞消化下来制备成细胞悬液加入到96孔板中，以5000个/mL的密度每孔接种100μL。培养至细胞贴壁后加入AFB1，至终浓度分别为0、0.5、10、50、100和200μM。然后将其放置在培养箱中分别共培养2h。通过微量移液器在96孔板中加入10μL CCK-8试剂，继续培养4h。最后用酶标仪测定450nm激发波长下的吸光值。利用下述公式计算细胞相对存活率：细胞相对存活率(RGR)＝(实验组吸光值—CCK8本底)/(对照组实验值—CCK8本底)×100％(图13)。当AFB1浓度达到100μM时，细胞的存活率在50％左右；低于100μM无法引起显著的细胞凋亡，而高于100μM又会引起超过半数的细胞凋亡。因此，选择100μM作为加入细胞中AFB1的最佳终浓度。

实施例8

细胞血浆提取物的蛋白质印迹分析：

待AFB1与细胞共同孵育0、0.5、1、1.5和2h后，利用胞质和线粒体蛋白质试剂盒提取出细胞质中的蛋白质，然后进行western blotting实验(图14)。由图可知，随着与AFB1孵育时间的增加，胞质内游离的Cyt c是在不断增加的。

实施例9

活细胞的拉曼检测和成像：

待细胞生长到对数生长期后，将细胞按80000个/mL的密度接种350μL到无菌石英片上。细胞培养至贴壁后，吸出旧培养基，加入混匀探针的基本培养基2mL，与细胞共培养24h。吸出含有探针的培养基并用PBS清洗三次，然后加入混有相同浓度的AFB1的基本培养基，分别共培养0、0.25、0.5、0.75、1、1.5和2h，马上进行SERS光谱检测和SERS成像(图15、16、17)。随着与AFB1孵育时间的增加，从线粒体内部游离至胞质内的的成熟的Cyt c浓度增加，与AuNTs表面的适配体DNA1特异性结合，导致DNA2的脱落，此时，1366cm^-1处Cy5的特征峰强度明显下降。以1366cm^-1处的SERS强度建立标准曲线，200～10000nM内呈现良好的线性关系。

实施例10

活细胞的荧光成像：

待细胞生长到对数生长期后，将细胞按40000个/mL的密度接种500μL到激光共聚焦专用小皿上。细胞培养至贴壁后，吸出旧培养基，加入混匀探针的基本培养基500μL，与细胞共培养24h。吸出含有探针的培养基并用PBS清洗三次，然后加入混有相同浓度的AFB1的基本培养基，分别共培养0、0.25、0.5、0.75、1、1.5和2h。然后吸出含有AFB1的培养基，用PBS清洗三次，并用DAPI染色3min。3min后清洗DAPI，并马上进行荧光成像(图17、18)。在1366cm^-1处Cy5的特征峰强度明显下降的同时，670nm处激光共聚焦的发光强度增加。以670nm处的激光共聚焦强度建立标准曲线，200～10000nM内呈现良好的线性关系。

实施例11

胞质内Cyt c的含量测定：

待细胞生长到10⁷个后，加入AFB1分别孵育不同时间，然后通过胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒提取出细胞质中有的蛋白质，最后通过人Cyt>

实施例12

拉曼-荧光双模式探针实际样品中Cyt c的检测：

将AFB1与细胞共培养0.33h，利用拉曼-荧光双模式探针进行定量检测(图20、21)，其中图20为拉曼光谱，图21为相应的共聚焦成像。基于1366cm^-1处的SERS强度和670nm处的共焦强度计算细胞内Cyt>

实施例13

拉曼-荧光双模式探针用于HepG2、HeLa和A549不同细胞系的通用性检测：

将AFB1与HepG2，HeLa和A549一起孵育0.67h后，检测SERS光谱并进行激光共聚焦成像(图22、23)。图22对应拉曼光谱，图23对应共聚焦成像。基于1366cm^-1处的SERS强度和670nm处的共焦强度计算细胞内Cyt>