一种皮层肌动蛋白突变体8KQ及应用

摘要

本发明提供了一种皮层肌动蛋白突变体8KQ及其应用，属于蛋白质多肽技术领域，所述皮层肌动蛋白突变体8KQ具有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列。所述皮层肌动蛋白突变体8KQ为将皮层肌动蛋白(NP_031829.2)的8个赖氨酸位点K107、K152、K171、K181、K193、K235、K309和K314突变为谷氨酰胺，模拟蛋白质乙酰化状态下的电荷特征。本发明所述皮层肌动蛋白突变体8KQ能够在培养细胞中成功表达，能够降低与纤维状肌动蛋白结合能力；可用于改善神经突触形态；可改善自闭症疾病模型小鼠的重复刻板行为，起效快，作用明显。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质多肽技术领域，尤其涉及一种皮层肌动蛋白突变体8KQ及其应用。

背景技术

自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder，ASD)是一类神经发育性疾病，可通过临床表现诊断。最新的《精神疾病诊断与统计手册》第五版、对ASD的诊断标准归纳为：社会交流障碍、重复刻板的动作或兴趣，如：很少与人交流、躲避对话者目光、喜欢重复旋转的玩具等。除了上述的核心症状外，ASD患者还可能表现出其他非典型的附加症状，如不同程度的智力障碍、失眠、焦虑、多动、癫痫等。在2000年ASD的发病率约为1～2‰。但随着诊断标准和诊断方式的改进，2017年发展中国家儿童ASD发病率已经达到1.5％，目前临床多以行为干预为主，研制ASD治疗潜能的药物极为重要。

ASD的发病原因不明确，目前研究认为与基因遗传和环境因素有关。遗传变异呈现高度异质性，限制了ASD发病机制研究和临床药物研发。临床病例观察和疾病动物模型研究表明，ASD存在严重的神经突触功能紊乱。许多ASD候选易感基因集中于兴奋性突触位点，包括突触支架蛋白、受体、细胞粘附分子和细胞骨架调节蛋白等编码基因以及它们的上游调节基因，这些遗传学变异直接影响树突棘形态和结构，从而改变兴奋性突触数目和强度，最终导致突触功能紊乱。SHANK3(SH3 and multiple ankyrin repeat domains 3)基因突变是第一个被报道、且被报道最多的与先天性ASD相关联的基因，它编码突触后支架蛋白，通过与突触后致密蛋白95(PSD95)、Homer形成蛋白复合物，锚定谷氨酸受体于突触后膜，维持突触功能的稳定。生理条件下SHANK3与皮层肌动蛋白相互作用，维持兴奋性突触形态和结构的稳定。在突触分布的皮层肌动蛋白是乙酰化形式，当它乙酰化水平降低时，削减突触传递的幅值，阻碍神经元之间信息传递。现有技术对ASD候选易感基因的研究多集中在基因水平。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于一种皮层肌动蛋白突变体8KQ及其应用；所述皮层肌动蛋白突变体8KQ通过模拟乙酰化的皮层肌动蛋白，有效改善兴奋性突触形态结构与功能，起到神经保护的作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种皮层肌动蛋白突变体8KQ，所述皮层肌动蛋白突变体8KQ具有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列。

本发明提供了编码所述皮层肌动蛋白突变体8KQ的基因，具有如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种重组病毒，包括编码所述皮层肌动蛋白突变体8KQ的基因和病毒载体。

优选的，所述病毒载体为腺相关病毒或慢病毒。

优选的，所述腺相关病毒为腺病毒9型。

本发明提供了所述的皮层肌动蛋白突变体8KQ在制备神经保护药物中的应用。

优选的，所述神经保护表现为补充皮层肌动蛋白乙酰化，维持兴奋性突触形态结构与功能稳定。

本发明提供了所述的皮层肌动蛋白突变体8KQ在制备治疗自闭症药物中的应用。

优选的，所述自闭症药物的适用对象为自闭症疾病模型小鼠。

优选的，所述自闭症药物为注射制剂。

本发明的有益效果：本发明提供的皮层肌动蛋白突变体8KQ，具有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列；所述皮层肌动蛋白突变体8KQ为将皮层肌动蛋白(NP_031829.2)的8个赖氨酸位点K107、K152、K171、K181、K193、K235、K309和K314突变为谷氨酰胺，模拟蛋白质乙酰化状态下的电荷特征。本发明所述皮层肌动蛋白突变体8KQ能够在培养细胞中成功表达，能够降低与纤维状肌动蛋白结合能力；将所述皮层肌动蛋白突变体8KQ构建在慢病毒载体上可收获病毒颗粒，获得大量持续乙酰化皮层肌动蛋白突变体，用于改善神经突触形态；将所述皮层肌动蛋白突变体8KQ构建在腺相关病毒载体，脑内注射有效改善自闭症疾病模型小鼠的重复刻板行为，起效快，作用明显。

本发明将编码所述皮层肌动蛋白突变体8KQ的基因重组至腺相关病毒或慢病毒中，能够实现皮层肌动蛋白突变体8KQ的大量表达，规模化工业生产，应用于改善突触形态和功能紊乱药物组合，用于制备神经保护类药物。

附图说明

图1为兴奋性突触表达乙酰化皮层肌动蛋白，其中(A)为体外培养的神经元(DIV21)免疫荧光染色图片；(B)为PSD95与cortactin、ac-cortactin的共定位分析；

图2为皮层肌动蛋白与不同浓度的Ac-CoA共同孵育后乙酰化水平；左图为westernblot检测的乙酰化皮层肌动蛋白的表达水平，考马斯亮蓝染色显示了底物皮层激动蛋白的量；右图为western blot结果中乙酰化皮层肌动蛋白相对水平的统计图，定义对照组乙酰化皮层肌动蛋白水平为100％，数据来源于三次独立实验；

图3为皮层激动蛋白乙酰化位点的鉴定，其中(A)为LC-MS/MS鉴定得到皮层肌动蛋白重复区域中8个赖氨酸被乙酰化；(B)为HEK293细胞过表达HA标签的皮层肌动蛋白突变体8KQ和western blot检测质粒表达；

图4为F-actin结合半定量实验结果图；

图5为过表达8KQ对神经元兴奋性突触后电流的影响，其中(A)为过表达8KQ的神经元与对照的神经元兴奋性突触后电流整体的比较，(B)为电流的振幅比较，(C)为电流的频率比较；

图6为乙酰化皮层肌动蛋白的模拟形式对改善小鼠ASD样行为学影响；其中(A)为腺相关病毒脑立体定位注射示意图；(B)为腺相关病毒注射和行为学测试时间安排示意图；(C)为每组小鼠重复刻板实验中自主理毛时间比较。

具体实施方式

本发明提供了一种皮层肌动蛋白突变体8KQ，所述皮层肌动蛋白突变体8KQ具有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，具体如下：

其中带有下划线的位点为定点突变位点；所述皮层肌动蛋白突变体8KQ为将皮层肌动蛋白(NP_031829.2，氨基酸序列如SEQ ID No：3所示)的8个赖氨酸位点K107、K152、K171、K181、K193、K235、K309和K314突变为谷氨酰胺，模拟蛋白质乙酰化状态下的电荷特征。蛋白质的乙酰化通常发生在赖氨酸(K)的残基，可在乙酰转移酶的催化下，与乙酰基供体乙酰辅酶A(Ac-CoA)发生共价结合，即电荷中和。本发明将pI＝9.74的K突变为pI＝5.65的谷氨酰胺(Q)，即模拟乙酰化状态下的电荷中和，得到皮层肌动蛋白的乙酰化形式8KQ。

本发明中，包括所述皮层肌动蛋白突变体8KQ的表达质粒，能够在体外培养的HEK293细胞中成功表达，能够降低与纤维状肌动蛋白结合能力；将所述皮层肌动蛋白突变体8KQ构建在慢病毒载体上可收获病毒颗粒，获得大量持续乙酰化皮层肌动蛋白突变体，用于改善神经突触形态；将所述皮层肌动蛋白突变体8KQ构建在腺相关病毒载体，脑内注射有效改善自闭症疾病模型小鼠的重复刻板行为，起效快，作用明显。

本发明还提供了编码所述皮层肌动蛋白突变体8KQ的基因，具有如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列；具体如下：

所述编码皮层肌动蛋白突变体8KQ的基因是通过将编码皮层肌动蛋白的基因(NM_007803.5，核苷酸序列如SEQ ID No：4所示)进行定点突变后获得其中带有下划线的位点为突变位点；由“A”突变为“C”。

本发明提供了一种重组病毒，包括所述皮层肌动蛋白8KQ的基因和病毒载体。在本发明中，所述病毒载体优选为腺相关病毒或慢病毒；所述腺相关病毒优选为腺病毒9型AAV9，所述腺病毒9型AAV9能够在神经系统中特异高表达；所述慢病毒载体优选为GV509。本发明对所述腺相关病毒和慢病毒的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明对所述重组病毒的制备方法没有特殊要求，采用本领域常规的重组病毒的制备方法即可。在本发明具体实施过程中，将所述编码皮层肌动蛋白突变体8KQ的基因序列连接到载体GV509的酶切位点BamHI和AfeI之间获得重组病毒。在本发明中，将编码所述皮层肌动蛋白突变体8KQ的基因重组至腺相关病毒或慢病毒中，能够实现皮层肌动蛋白突变体8KQ的大量表达，规模化工业生产，应用于改善突触形态和功能紊乱药物组合，用于制备神经保护类药物。

本发明还提供了所述的皮层肌动蛋白突变体8KQ在制备神经保护药物中的应用。在本发明中，所述皮层肌动蛋白突变体8KQ能够模拟皮层肌动蛋白的乙酰化状态下的电荷特征，能够有效改善兴奋性突触形态结构与功能，起到神经保护的作用。本发明中，所述神经保护优选的表现为补充皮层肌动蛋白乙酰化，维持兴奋性突触形态结构与功能稳定。

本发明还提供了所述的皮层肌动蛋白突变体8KQ在制备治疗自闭症药物中的应用。本发明对所述自闭症药物的适用对象没有特殊限定，在本发明实施例中优选以自闭症疾病模型小鼠为对象。本发明对所述所述自闭症药物的剂型没有特殊限定，采用本领域常规剂型即可，在本发明实施例中优选为注射制剂。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

兴奋性突触表达乙酰化皮层肌动蛋白

提前用多聚赖氨酸(PLL)包被培养皿或载玻片，室温包被过夜或37℃包被2h。回收PLL，无菌水漂洗3次，包被后的培养皿或载玻片置于4℃可保存1周。预冷HBSS缓冲液，并注意消化前操作保持低温无菌。将出生当天乳鼠冰晕，75％酒精消毒，迅速取脑。于HBSS中剥离海马/皮层组织，轻轻转移到装有新鲜HBSS的EP管中。剪成小块，37℃胰酶(0.125％)消化30min，期间每隔10min将组织块轻柔重悬。用含有10％FBS的F12培养基终止消化，800rpm离心1min，去上清。加入F12+10％FBS培养基重悬，37℃静置5min。用移液器轻柔吹打细胞团块，静置2min，上清即为神经元混悬液。细胞计数，铺板。培养24h后将培养基换成Neurobasal(Gibco#10888022)培养基，并添加2％B27(Gibco#17504044)和1％Glutamax(Gibco#35050061)，并每隔2天，半量换液。

体外培养神经元，培养条件要求稳定的温度(37℃)、稳定的CO₂水平(5％)、较高的相对饱和湿度(95％)，至21天(DIV21)为成熟神经元，表达突触标志蛋白PSD95，称为PSD95聚集。突触后致密蛋白95(PSD95)是兴奋性突触标记物。利用免疫荧光染色，分别标记皮层肌动蛋白(cortactin)与乙酰化皮层肌动蛋白(ac-cortactin)在突触后表达位置。

免疫荧光染色具体操作为：将附着生长在盖玻片上的神经元用PBS缓冲液漂洗3次，5min/次。预冷的PFA(4％)室温固定10min，PBS漂洗3次，5min/次。0.2％Triton(PBS配制)室温透化10min，PBS漂洗3次，5min/次。5％BSA(PBST配制)室温封闭30min，一抗(封闭液配制)4℃孵育过夜。PBST漂洗3次，10min/次。二抗(封闭液配制)室温孵育1.5h。PBST漂洗3次，10min/次，封片。激光共聚焦(Zeiss LSM 780)获取免疫荧光结果如图1A，ImageJ可分析皮层肌动蛋白和乙酰化皮层肌动蛋白与PSD95的共定位情况，由共定位系数(overlapcoefficient)表示。皮层肌动蛋白(cortactin)与乙酰化皮层肌动蛋白(ac-cortactin)在突触后表达与PSD95有共定位，免疫荧光染色结果显示乙酰化皮层肌动蛋白在突触后含量较高。

实施例2

研究表明皮层肌动蛋白的乙酰化受到乙酰转移酶(PCAF)和去乙酰化酶(HDAC6)调节，可能还存在非酶乙酰化作用。乙酰辅酶A(Ac-CoA)是蛋白乙酰化所需乙酰基的唯一来源，细胞内Ac-CoA浓度影响蛋白质的乙酰化修饰水平。为探讨这一可能性及其生物学意义，进行了体外乙酰化实验。反应缓冲液：Tris-HCl(50mM，pH8.0)，EDTA(0.1mM)，DTT(1mM)，甘油(10％)，丁酸钠(10mM)，使用前加入蛋白酶抑制剂。反应底物：皮层肌动蛋白，乙酰基供体Ac-CoA。将反应体系于30℃孵育1h，得到的反应产物用于Western blot抗体检测，所用到的抗体为泛乙酰化抗体acetylated-lysine；底物皮层肌动蛋白的加入量由考马斯亮蓝染色表示。在体外乙酰化反应中，将皮层肌动蛋白与不同浓度的Ac-CoA共同孵育后发现，随着Ac-CoA浓度的升高，皮层肌动蛋白乙酰化水平也呈现升高的趋势，二者具有显著正相关(图2)，说明皮层肌动蛋白乙酰化与Ac-CoA水平密切相关。

实施例3

皮层肌动蛋白乙酰化位点的鉴定

为了进一步探讨皮层肌动蛋白乙酰化在突触后结构和功能调节中的作用，利用LC-MS/MS方法，鉴定体外乙酰化实验(图2)中皮层肌动蛋白的乙酰化位点。将考马斯亮蓝染色显示的皮层肌动蛋白所在位置的SDS胶条切下，由杭州景杰生物科技有限公司完成后续LC-MS/MS过程。具体过程如下：将胶条切碎，使用含50mM碳酸氢铵(NH4HCO3)的50％乙腈(acetonitrile)将胶块脱色。利用100％乙腈孵育5min将胶块脱水，之后移去体系中液相，加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇(dithiothreitol)溶液，37℃孵育60min。再次使用100％乙腈孵育脱水，移去液相后加入终浓度为55mM的碘代乙酰胺(iodoacetamide)，室温避光孵育45min。之后使用终浓度为50mM的碳酸氢铵清洗，再次使用100％乙腈孵育脱水。最后使用含有10ng/μl胰蛋白酶(trypsin)的50mM碳酸氢铵重悬胶块，冰上孵育1h。除去样品中多余的溶液后，将胶块在37℃酶解过夜。酶解后的肽段依次使用50％乙腈/5％甲酸和100％乙腈提取出胶块，肽段溶液冷冻旋干后备用。肽段用流动相A溶解后，经EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。液相梯度设置：0～22min4％～35％B相；22～27min35％～80％B相；27～30min80％B相，流速维持在400nL/min。肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进Thermo ScientificTM Q ExactiveTM Plus质谱进行分析。离子源电压设置为2.0kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1800m/z，扫描分辨率设置为70,000；Orbitrap扫描分辨率设置为17,500。数据采集模式使用数据依赖型扫描(DDA)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20个肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用28％的破碎能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制(AGC)设置为5E4，信号阈值设置为5000ions/s，最大注入时间设置为200ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为15s以减少母离子的重复扫描。二级质谱数据使用Proteome Discoverer 1.3进行检索。检索参数设置如下：数据库设置为cortactin蛋白序列；酶切方式设置为Trypsin/P；漏切位点数设置为4；一级母离子质量误差容忍度设置为10ppm；二级碎片离子的质量误差容忍度设置为0.02Da；固定修饰设置为半胱氨酸烷基化；可变修饰设置为赖氨酸的乙酰化，甲硫氨酸的氧化和蛋白N端的乙酰化；肽段离子打分要求高于20，鉴定结果peptide confidence设置为High。

如图3所示，共有8个位点被检测到具有乙酰化修饰(K107、K152、K171、K181、K193、K235、K309和K314)。这些位点全部在皮层肌动蛋白的repeat region结构域。利用改变电荷的策略，设计构建了模拟乙酰化皮层肌动蛋白形式的皮层肌动蛋白突变体8KQ，即把8个乙酰化残基赖氨酸(K，pI＝9.74)突变为带负电荷的谷氨酰胺(Q，pI＝5.65)，模拟乙酰化状态下的电荷中和；同理，将8个乙酰化残基K突变为等电点相近的精氨酸(R，pI＝10.76)，构建得到模拟cortactin非乙酰化形式cortactin-8KR。突变过程借助定点突变试剂盒(QuikChange Site-directed Mutagenesis kit)完成。将质粒cortactin-8KQ和8KR在HEK293细胞中进行PEI转染，48h后提取细胞全蛋白进行westernblot检测，HA抗体检测证明8KQ和8KR成功表达(图3)。

实施例4

乙酰化皮层肌动蛋白的生物学作用

皮层肌动蛋白能够与F-actin结合并调节actin的成核过程，影响细胞骨架活动性。皮层肌动蛋白的这一功能受到其乙酰化修饰水平的影响，皮层肌动蛋白乙酰化时阻碍其与F-actin结合的因素。当乙酰化皮层肌动蛋水平降低时，皮层肌动蛋与F-actin结合能力增强(图4)。

F-actin体外结合实验操作如下：准备实验所需的G-actin缓冲液(G-buffer)和F-actin缓冲液(F-buffer)，即G-buffer：Tris-HCl(5mM，pH8.0)、CaCl₂(0.2mM)、ATP(0.2mM)、DTT(0.5mM)；F-buffer：Tris-HCl(2mM，pH8.0)、CaCl₂(0.2mM)、ATP(1mM)、DTT(0.2mM)、KCl(50mM)、MgCl₂(2mM)。将购买的actin蛋白溶解于G-buffer中，-80℃贮存。

体外培养HEK293细胞分别转染8KQ和8KR，48h后弃除细胞培养基，用预冷的PBS漂洗两次，加入适量体积预冷的G-buffer，冰上孵育15min。用细胞刮刀将神经元刮离培养皿，将混悬液置于预冷的玻璃匀浆器，冰上匀浆约30次。10000g，4℃，离心10min，取上清，可作为input检测内源cortactin的表达。将细胞蛋白溶液浓度调齐，将1mg蛋白溶液与30μgactin蛋白混匀于F-buffer中，冰浴1h。加入1/4总体积的10％(W/V)蔗糖溶液(F-buffer配制)，100000g，4℃，离心1h。此时获得的上清(S)为不能与细胞蛋白溶液中cortactin结合的G-actin，沉淀为cortactin结合F-actin的复合物。向沉淀(P)中加入适当体积的G-buffer，4℃孵育2h，使F-actin转变为G-actin。将获得的S和P分别用于Western blot检测，由于实验体系中总actin、总cortactin量一致，所以只需比较不同实验组与F-actin相互结合的cortactin的量即可。

体外F-actin结合半定量实验结果显示，与野生型皮层肌动蛋白(WT)相比，cortactin-8KQ模拟了乙酰化的皮层肌动蛋白，与F-actin结合能力下降；反之，cortactin-8KR与F-actin结合能力上升(图4)。该结果证明，构建的cortactin-8KQ、8KR能够模拟乙酰化和非乙酰化cortactin的功能。

实施例5

皮层肌动蛋白突变体8KQ的表达不影响正常神经元功能

如实施例1中方法体外培养神经元至第10天，侵染慢病毒LV-cortactin 8KQ-EGFP，第14天时单细胞膜片钳技术记录神经元电生理功能情况。采用EPC-10/2放大器(HEKA，德国)以电压钳模式进行全细胞膜片钳记录。记录电极由硼硅酸盐玻璃毛细管(Warner Instruments)自制，电阻为3～5MΩ。只有串联电阻<15MΩ的全细胞贴片用于记录。膜电位保持在-70mV，电极内溶液组成：130mM葡萄糖酸钾，1mM EGTA，5mM Na2ATP，2mMMgATP，0.3mM Na2GTP，5mM QX-314和10mM HEPES(pH 7.3)。浴液组成：25mM HEPES(pH7.3)，128mM NaCl，30mM葡萄糖，5mM KCl，5mM CaCl2，1mM MgCl2，50μM D-AP5，20μM荷包牡丹碱。D-AP5、荷包牡丹碱和QX-314来自TOCRIS Bioscience，其他化学品来自Sigma-Aldrich。当记录mEPSC时，将1μM河豚毒素(TOCRIS Bioscience)加入浴液中。使用PATCHMASTER软件(HEKA，Germany)获取数据，并使用MiniAnalysis软件(Synaptosoft)、Clampfit(Molecular Devices)和Igor(Wavemetrics)进行分析。

慢病毒LV-cortactin 8KQ-EGFP可以介导8KQ表达，在野生(WT)神经元中过表达8KQ并没有影响神经元兴奋性兴奋性突触后电流(图5A)，与侵染只表达EGFP的对照(control)相比，过表达8KQ的神经元兴奋性突触后电流的振幅(图5B)和频率(图5C)均未见显著变化。说明乙酰化皮层肌动蛋白8KQ的过表达并不影响野生神经元的功能。

实施例6

脑内注射模拟乙酰化皮层肌动蛋白可以改善小鼠自闭症样行为

通过脑立体定位注射技术，向小鼠脑皮层区域注射腺相关病毒AAV9-CamKII-GFP-8KQ(结构如图6A)。按照0.1ml/g的比例腹腔注射1％戊巴比妥钠，小鼠被麻醉后，固定于脑立体定位仪上，确保头部稳定。将红霉素软膏涂抹于小鼠眼球，保护角膜因长时间暴露和灯光照射造成损伤。75％酒精消毒小鼠头部被毛和皮肤，沿矢状缝切～1cm长切口，小心剥离皮肤，用2％双氧水清洗表面筋膜，暴露头骨。标记并记录小鼠前囟(Bregma)位置，利用脑立体定位仪坐标，移动微量注射器位置，分别标记以下四处：(1)anteroposterior(AP)，2.0mm；mediolateral(ML)，0.5mm；dorsoventral(DV)，1.3mm；(2)AP，-1.0mm；ML，2.0mm；DV，0.8mm。牙钻(0.5mm)小心钻孔，并用棉签清理周围骨屑。将微量注射器(Hamilton)固定于电子微量注射泵上，下针到指定位置后停留2min，注射速度选择0.2μl/min，注射结束后停留2min，缓慢提针。所有位置注射结束后，缝合切口。

该腺相关病毒(AAV9-CamKII-GFP-8KQ)具有兴奋神经元特异表达启动子CamKII，表达位置与DIP2A高表达的神经元类型一致。Dip2a敲除小鼠由本实验室通过CRISPR Cas9技术制备，利用行为学实验筛选发现有自闭症样行为学表型，包括重复刻板动作(过度自主理毛)和轻微的社交障碍，在后续实验中将其作为小鼠自闭症模型。病毒在小鼠出生后4周注射，经过4周的病毒扩散，行为学测试在小鼠出生后8周进行(图6B)。

将小鼠置于铺有干净垫料的鼠笼，适应环境10min。记录接下来10min内，小鼠重复刻板动作-直立探索和理毛的频次和时间。腺相关病毒侵染介导的8KQ表达，能够补救Dip2aKO重复刻板的自主理毛行为(图6C)。与注射对照病毒的KO小鼠对比，注射8KQ腺相关病毒的小鼠自主理毛的时间明显降低。因此，8KQ对ASD有部分治疗作用。

由上述实施例可知，本发明提供的皮层肌动蛋白突变体8KQ通过定点突变，能够模拟皮层肌动蛋白的乙酰化电荷状态；所述皮层肌动蛋白突变体8KQ可以改善小鼠自闭症样行为。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 东北师范大学

<120> 一种皮层肌动蛋白突变体8KQ及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 546

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Trp Lys Ala Ser Ala Gly His Ala Val Ser Ile Thr Gln Asp Asp

1 5 1015

Gly Gly Ala Asp Asp Trp Glu Thr Asp Pro Asp Phe Val Asn Asp Val

202530

Ser Glu Lys Glu Gln Arg Trp Gly Ala Lys Thr Val Gln Gly Ser Gly

354045

His Gln Glu His Ile Asn Ile His Lys Leu Arg Glu Asn Val Phe Gln

505560

Glu His Gln Thr Leu Lys Glu Lys Glu Leu Glu Thr Gly Pro Lys Ala

65707580

Ser His Gly Tyr Gly Gly Lys Phe Gly Val Glu Gln Asp Arg Met Asp

859095

Arg Ser Ala Val Gly His Glu Tyr Gln Ser Gln Leu Ser Lys His Cys

100 105 110

Ser Gln Val Asp Ser Val Arg Gly Phe Gly Gly Lys Phe Gly Val Gln

115 120 125

Met Asp Arg Val Asp Gln Ser Ala Val Gly Phe Glu Tyr Gln Gly Lys

130 135 140

Thr Glu Lys His Ala Ser Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Gly Phe Gly Gly

145 150 155 160

Lys Tyr Gly Val Gln Ala Asp Arg Val Asp Gln Ser Ala Val Gly Phe

165 170 175

Asp Tyr Gln Gly Gln Thr Glu Lys His Glu Ser Gln Lys Asp Tyr Ser

180 185 190

Gln Gly Phe Gly Gly Lys Tyr Gly Ile Asp Lys Asp Lys Val Asp Lys

195 200 205

Ser Ala Val Gly Phe Glu Tyr Gln Gly Lys Thr Glu Lys His Glu Ser

210 215 220

Gln Lys Asp Tyr Val Lys Gly Phe Gly Gly Gln Phe Gly Val Gln Thr

225 230 235 240

Asp Arg Gln Asp Lys Cys Ala Leu Gly Trp Asp His Gln Glu Lys Leu

245 250 255

Gln Leu His Glu Ser Gln Lys Asp Tyr Lys Thr Gly Phe Gly Gly Lys

260 265 270

Phe Gly Val Gln Ser Glu Arg Gln Asp Ser Ser Ala Val Gly Phe Asp

275 280 285

Tyr Lys Glu Arg Leu Ala Lys His Glu Ser Gln Gln Asp Tyr Ala Lys

290 295 300

Gly Phe Gly Gly Gln Tyr Gly Val Gln Gln Asp Arg Met Asp Lys Asn

305 310 315 320

Ala Ser Thr Phe Glu Glu Val Val Gln Val Pro Ser Ala Tyr Gln Lys

325 330 335

Thr Val Pro Ile Glu Ala Val Thr Ser Lys Thr Ser Asn Ile Arg Ala

340 345 350

Asn Phe Glu Asn Leu Ala Lys Glu Arg Glu Gln Glu Asp Arg Arg Lys

355 360 365

Ala Glu Ala Glu Arg Ala Gln Arg Met Ala Lys Glu Arg Gln Glu Gln

370 375 380

Glu Glu Ala Arg Arg Lys Leu Glu Glu Gln Ala Arg Ala Lys Lys Gln

385 390 395 400

Thr Pro Pro Ala Ser Pro Ser Pro Gln Pro Ile Glu Asp Arg Pro Pro

405 410 415

Ser Ser Pro Ile Tyr Glu Asp Ala Ala Pro Phe Lys Ala Glu Pro Ser

420 425 430

Tyr Arg Gly Ser Glu Pro Glu Pro Glu Tyr Ser Ile Glu Ala Ala Gly

435 440 445

Ile Pro Glu Ala Gly Ser Gln Gln Gly Leu Thr Tyr Thr Ser Glu Pro

450 455 460

Val Tyr Glu Thr Thr Glu Ala Pro Gly His Tyr Gln Ala Glu Asp Asp

465 470 475 480

Thr Tyr Asp Gly Tyr Glu Ser Asp Leu Gly Ile Thr Ala Ile Ala Leu

485 490 495

Tyr Asp Tyr Gln Ala Ala Gly Asp Asp Glu Ile Ser Phe Asp Pro Asp

500 505 510

Asp Ile Ile Thr Asn Ile Glu Met Ile Asp Asp Gly Trp Trp Arg Gly

515 520 525

Val Cys Lys Gly Arg Tyr Gly Leu Phe Pro Ala Asn Tyr Val Glu Leu

530 535 540

Arg Gln

545

<210> 2

<211> 1641

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtggaaag cctctgcagg ccatgctgtg tccatcacgc aggatgatgg aggagctgat 60

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gacagacagg acaagtgtgc ccttggctgg gaccatcagg agaagctgca gctgcatgaa 780

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tatgtggagc tgcggcagta g 1641

<210> 3

<211> 546

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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1 5 1015

Gly Gly Ala Asp Asp Trp Glu Thr Asp Pro Asp Phe Val Asn Asp Val

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Ser His Gly Tyr Gly Gly Lys Phe Gly Val Glu Gln Asp Arg Met Asp

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100 105 110

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Met Asp Arg Val Asp Gln Ser Ala Val Gly Phe Glu Tyr Gln Gly Lys

130 135 140

Thr Glu Lys His Ala Ser Gln Lys Asp Tyr Ser Ser Gly Phe Gly Gly

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Lys Tyr Gly Val Gln Ala Asp Arg Val Asp Lys Ser Ala Val Gly Phe

165 170 175

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275 280 285

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Glu Glu Ala Arg Arg Lys Leu Glu Glu Gln Ala Arg Ala Lys Lys Gln

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420 425 430

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500 505 510

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tatgtggagc tgcggcagta g 1641