基于GC-Q-Orbitrap的食用农产品中农药化合物电子身份数据库及检测方法

摘要

本发明公开了一种基于GC‑Q‑Orbitrap的食用农产品中农药化合物电子身份数据库及检测方法；所述电子身份数据库包含多种农药化合物电子身份证信息的集合，并按照电子身份证中的按保留时间进行排序，其中电子身份证包括农药化合物信息、保留时间、质谱图、以及碎片离子信息和智能匹配值；检测方法包括样品前处理步骤、GC‑Q‑Orbitrap操作条件设置和样品中农药残留筛查过程；其中GC‑Q‑Orbitrap操作条件设置包括设置合适的色谱条件和质谱条件，农药筛查过程中首先利用保留时间查找电子身份数据库中农药化合物，若匹配则提取对应电子身份证信息，然后再比较智能匹配值，小于阈值则记录和显示结果，筛查完成。

说明书

技术领域

本发明设计基于GC-Q-Orbitrap的食用农产品中农药化合物电子身份数据库及检测方法，该发明能实现针对多种食用农产品中600多种农药残留的非靶标、多指标、快速筛查。

背景技术

早在1976年世界卫生组织(WHO)、粮农组织(FAO)和联合国环境规划署(UNEP)共同建立了全球环境检测系统/食品项目(Global Environment Monitoring System，GEMS/Food)，旨在掌握会员国食品污染状况，了解食品污染物摄入量，保护人体健康，促进贸易发展。现在，世界各国都把食品安全提升到国家安全的战略地位。农药残留限量是食品安全标准之一，也是国际贸易准入门槛。同时，对农药残留的要求呈现出品种越来越多，限量越来越严格的发展趋势，也就是国际贸易设立的农药残留限量门槛越来越高。例如，欧盟、日本和美国分别制定了169068项(481种农药)，44340项(765种农药)，13055项(395种农药)农药残留限量标准，我国2016年发布了433种农药的4140项MRL标准。目前，国际上普遍采用的一律标准限量为10μg/kg。因此，食品安全和国际贸易都呼唤高通量快速农药残留检测技术，这无疑也给广大农药残留分析工作者提供了机遇和挑战。在目前的众多农药残留分析技术中，色谱质谱联用技术是实现高通量多残留快速检测的最佳分析手段。

目前农药残留分析多以气相色谱、液相色谱、气相色谱-质谱和液相色谱-质谱联用技术为主。这些检测技术都首先需要农药标准品对照进行定性。例如，对100种农药的检测就需要准备相应的100种农药标准品对照，而这100种之外的农药都会被漏检。在农药残留实验室的实际工作中，绝大多数实验室都不会储备数百种农药标准品，其原因是农药标准品不仅价格昂贵，而且有效期只有2、3年，需要重复投资。一般实验室常备农药标准品只有几十种，其日常监测的农药品种也就只限于这几十种，由此造成食品安全监测漏洞。

发明内容

本发明针对目前农药残留筛查技术方法中无法实现对多种农药同时快速检测的问题，开发了一种基于GC-Q-Orbitrap的食用农产品的农药化合物电子身份数据库及检测方法，实现了不需标准品对照、即可同时对农产品中600多种农药残留快速筛查检测，满足了当前农产品中农药残留高通量快速检测的急需。

本发明采取如下技术方案：

一种基于GC-Q-Orbitrap的食用农产品中农药化合物电子身份数据库，包括多种农药化合物电子身份证，所述电子身份证包括农药化合物信息、保留时间、质谱图、以及碎片离子信息，其特征在于：

所述农药化合物信息包括化合物名称、化合物分子式；

制备农药化合物样品，通过GC-Q-Orbitrap仪器在Full MS模式下获得所述农药化合物指定色谱质谱条件下的色谱图，所述色谱图中的色谱峰处时间即为所述保留时间；

所述质谱图是所述保留时间下通过GC-Q-Orbitrap仪器获得的一级全扫描图；

所述碎片离子由所述质谱图中选择确定，所述碎片离子包括1个基峰离子和多个确证离子，所述基峰离子为信号强度高、质量数大的碎片离子，所述基峰离子不选同位素峰的离子；

所述碎片离子信息包括离子丰度比和理论精确质量数；

所述离子丰度比是碎片离子与基峰离子的信号强度比；

所述数据库按照电子身份证中的按保留时间进行排序。

进一步，所述电子身份数据库还包括智能匹配模型，匹配模型在所述电子身份证中增加智能匹配值P_m，其计算模型为：

W_b+W_q＝1；

其中M_b为基峰离子的理论精确质量数，M_i为第i个确证离子的精确质量数，W_i为权重，I_i为第i个确证离子的离子丰度比，确证离子的排列顺序为离子丰度比的从大到小；W_b为基峰离子的权重，W_q为确证离子的综合权重，n为碎片离子的个数。

进一步，所述W_b，W_q可根据智能匹配模型的变化进行调整，一般取值为W_b＝W_q＝0.5。

进一步，所述碎片离子的选择依据离子丰度和离子质量数，所述离子丰度为所述质谱图中离子的信号强度，所述碎片离子数为5个，所述碎片离子选择的原则为：

如果ΔI>10％，则选取I_i,I_j中的最大值，否则选取M_i,M_j中的最大值；

其中：I_i，I_j为最相近的两个碎片离子的离子丰度比，ΔI＝|I_i-I_j|，M_i,M_j为上述最相近的两个碎片离子的精确质量数，所述离子碎片的排列顺序为按照离子丰度比从大到小。

进一步，所述碎片离子的理论精确质量数的确定方法为：

1)根据化合物分子式，明确碎片离子元素组成；

2)根据质谱图中碎片离子的质量数M，通过计算获得可能的碎片离子元素组成列表；

其中：M_i为第i个碎片离子元素精确质量数，n为碎片离子的元素数，y_i为第i个碎片离子对应元素的个数。

3)通过分子结构的裂解机理从碎片离子元素组成列表中选择合理的碎片离子元素组成，并计算其理论精确质量M′。

M′＝M₁y′₁+M₂y′₂+…+M_ny′_n

其中：M₁、M₂……M_n为所述碎片离子元素精确质量数，y′₁、y′₂、……y′_n为优选碎片离子元素组成的对应元素的个数。

进一步，所述色谱图中出现两个及以上色谱峰时，计算所述农药化合物的保留指数，通过所述保留指数与所述农药化合物的标准保留指数相近程度确定所述农药化合物的保留时间；

所述保留指数R_I的计算方法为：

所述t_R为校正保留时间,所述z和z+1分别为农药化合物(x)流出前后的正构烷烃所含碳原子的数目，所述t_R(z)<t_R(x)<t_R(z+1),一般农药化合物中正构烷烃所含碳原子的数目z大于4。

进一步，所述色谱质谱条件为：

色谱条件：气相色谱柱为TG-5SILMS，30m×0.25mm(i.d.)×0.25μm质谱专用柱；程序升温过程：40℃保持1min，然后以30℃/min程序升温至130℃，再以5℃/min升温至250℃，再以10℃/min升温至300℃，保持5min；载气：氦气，纯度≥99.999％，流速1.2mL/min；进样口类型：PTV；进样量：1μL；进样方式：程序升温进样，不分流时间1.5min；

质谱条件：EI源电压：70eV；离子源温度：230℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟：4min。扫描方式：Full MS；质量扫描范围50-600m/z，分辨率60,000FHWM(200m/z)；环氧七氯用于调整保留时间。

一种基于GC-Q-Orbitrap的食用农产品中农药化合物检测方法，包括：

1)将待检测样品经醋酸乙腈匀浆提取，经脱水和离心、浓缩后，再经Carbon/NH2柱净化，乙腈+甲苯洗脱残留农药，经浓缩、过滤后制成待测样品溶液；

2)通过GC-Q-Orbitrap仪器在Full MS模式下获得样品溶液指定色谱质谱条件下的色谱图和质谱图；

3)提取色谱图中的所有保留时间及其对应的精确质量数，建立所有保留时间对应的未知物的电子身份证；

4)依次将未知物电子身份证与电子身份数据库中每个农药化合物的电子身份证比较,如果ΔT≤0.15并且ΔP≤10％,则记录该农药化合物，否则进入下一个未知物电子身份证的比较；

5)检测完成，显示样品溶液中所含农药化合物的信息；

其中ΔT为未知物保留时间与数据库中任一农药化合物保留时间的差值，其中P_c为未知物智能匹配值,P_i数据库中任一农药化合物智能匹配值。

进一步，步骤4)中如果ΔT≤0.15并且10％<ΔP≤30％，则通过质谱图中质谱峰的高度和重合度确定度判断是否包括该农药化合物。

进一步，步骤1)所述样品的前处理：

称取10.0g样品(精确到0.01g)于100mL离心管中，加入30～40mL酸化乙腈提取液，10000～11000rpm均质1～2min；加入无水硫酸镁和氯化钠(质量比，4:1)，振荡8～10min；4200rpm离心5～7min后，取15～20mL上清液于150mL鸡心瓶中，40℃水浴加热旋转蒸发至1～2mL，待净化；

使用CarbonNH2柱，在CarbonNH2柱内加入约1～2cm高的无水硫酸钠，用5～6mL乙腈-甲苯溶液预洗SPE净化柱，同时轻敲净化柱排出柱内气泡，净化柱下方流出液弃；待液面略高于硫酸钠顶部时，将浓缩液转移入净化柱，下接50mL鸡心瓶；用2～3mL乙腈-甲苯溶液冲洗沾有样品的鸡心瓶，将洗涤液转移至净化柱内，重复2～3次；柱上接25mL储液器，以25～30mL乙腈-甲苯溶液洗脱；收集完毕后旋转蒸发至约0.5mL，氮吹至近干，加入1mL乙酸乙酯溶液，超声溶解后经0.22μm尼龙膜过滤。

本发明的有益效果：

1.本发明根据每种农药化合物建立了对应的GC-Q-Orbitrap检测条件下的电子身份证，建立电子身份证时创新性的利用每种农药自身独有的保留指数信息，辅助农药化合物的确认，极大地增加了电子身份证的准确信和可靠性。

2.本发明建立每种农药自身独有的电子身份证信息，电子身份证包括农药化合物信息、保留时间、质谱图、以及碎片离子信息，为提高比对的精度和可操作性，优化的选取了典型性的碎片离子作为比较依据，并通过设定基峰离子确定了核心比对的碎片离子信息。该发明的方案使得在食品农药检测中无需准备农药标准品，以电子标准筛查方法取代农药实物标准作参比的传统鉴定方法，实现高精度、高效率、节约资源的非靶标农药残留检测。实现了农药残留检测技术的跨跃发展。

3.本发明已经完成了600多种农药化合物的电子身份证信息的提取，建立了相应的电子身份数据库，该数据库利用理论精确质量数实现了5ppm的精度，更重要的是通过一次对食品的GC-Q-Orbitrap检测能同时检测中多种农药残存信息，经过数据库的比对能实现农药的快速筛查和确证，80％左右农药筛查灵敏度低于一律标准10微克/千克，极大地降低了假阳性检出结果，较好地满足各国农药残留MRL水平筛查的要求。

4.采用理论精确质量数作为碎片离子的检测精确质量数，能有效规避农药化合物确定不准确和同位素峰的问题，提高整个检测的准确性，减少因检测设备的干扰导致的检测结果不准确等情况。理论精确质量采用的理论推算方式综合利用了农药化合物分子结构的裂解机理，更加提高了电子身份证和数据库的建立准确性，提高检测的精确性。

5.本专利引入了碎片离子的选择模型，能够实现碎片离子的自动快速选择，同时通过引入智能匹配值模型，为每种化合物计算出快速自动比较的智能匹配值，智能匹配值兼顾了精确质量数和离子丰度比的信息，并根据基峰离子和不同确信离子间差异化的离子丰度比突出差距较大的离子碎片的影响，通过智能匹配值的引入改变了原有的根据人为判断的不足，能够实现精确的制动匹配，真正实现检测的自动化。

附图说明

图1 GC-Q-Orbitrap农药化学物电子身份数据库模型

图2 Dicofol溶剂标准的总离子流色谱图

图3 Dicofol溶剂标准19.19min处峰的一级质谱图

图4 Dicofol溶剂标准27.40min处峰的一级质谱图

图5 GC-Q-Orbitrap高分辨质谱谱图库中5种代表农药质谱图示例

图6农药残留检测方法流程

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

图1表示GC-Q-Orbitrap农药化学物电子身份数据库模型，其中包括包括多种农药化合物电子身份证，所述电子身份证包括农药化合物信息、保留时间、质谱图、碎片离子信息和智能匹配值。

下面以Dicofol为例，对农药化合物电子身份证的建立过程进行详细介绍：

色谱条件：气相色谱柱为TG-5SILMS，30m×0.25mm(i.d.)×0.25μm质谱专用柱。程序升温过程：40℃保持1min，然后以30℃/min程序升温至130℃，再以5℃/min升温至250℃，再以10℃/min升温至300℃，保持5min；载气：氦气，纯度≥99.999％，流速1.2mL/min；进样口类型：PTV；进样量：1μL；进样方式：程序升温进样，不分流时间1.5min。

质谱条件：EI源电压：70eV；离子源温度：230℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟：4min。扫描方式：Full MS；质量扫描范围50-600m/z，分辨率60,000FHWM(200m/z)；环氧七氯用于调整保留时间；通过TraceFinder(Version.4.0)对数据采集。

采用PTV模式进样，在Full MS模式下对其溶剂标准进行测定，其分子式为C₁₄H₉Cl₅O，Dicofol溶剂标准的总离子流色谱图如图2所示，在19.19min和27.40min处出现两个色谱峰，19.19min处质谱图(图3)和27.40min处质谱图(图4)比较发现，虽然两处峰的保留时间不一致但离子种类和离子丰度非常接近，无法通过推断离子组成和精确质量数进行区分和鉴别，为此增加保留指数辅助判断。计算19.19min处峰的保留指数为1995，27.40min处峰的保留指数为2476，查找现有资料中Dicofol的保留指数为2467，通过保留指数比对发现27.40min处峰保留指数更接近原有出峰规律，所以Dicofol的出峰时间确定为27.40min。在27.40处推断其5个实际测定的一级碎片分别为138.99464，140.99152，215.02583，251.00265和249.99475，从而结合结构式信息和分子式可以对其5个一级碎片的理论值进行确定，分别为基峰离子C₇ClH₄O(138.99452,丰度100.0)，确证离子C₇³⁷ClH₄O(140.99157,丰度33.2)，C₁₃ClH₈O(215.02582,丰度17.9)，C₁₃Cl₂H₉O(251.00250,丰度29.9)和C₁₃H₈OCl₂(249.99469,丰度19.6)，5个离子的质量偏差均小于2ppm，根据上述碎片离子值计算的智能匹配值为：183.07860，计算过程如下：

按照图1所示，Dicofol的离子精确质量数及其碎片精确质量数的理论值将会被导入软件，构建精确质量数据库，确证的一级质谱图也会导入谱图库。上述保留时间信息和一级质谱信息便构成了Dicofol的电子身份证。

通过上述实施例的方式，本发明创造进行了大量的实验验证工作，并完成了600种以上世界常用农药电子身份数据库的建立，实现了以电子标准取代农药实物标准。该方法优化并确定了农药残留GC-Q-Orbitrap筛查参数和条件，实现测试结果与农药电子身份数据库的自动比对。这一过程实现了高速度(40分钟)、高通量(600种以上)、高精度(0.00001m/z)、高可靠性(6个确证点以上)、高度信息化和自动化。同时实现了一次样本制备，采用GC-Q-Orbitrap检测技术同时快速筛查600多种农药，实现食用农产品农药残留多指标、非靶标、快速筛查；显著提高了技术的发现能力和方法效能。表1给出了GC-Q-Orbitrap精确质量数据库中5种代表农药化合物电子身份证示例和图5GC-Q-Orbitrap高分辨质谱谱图库中5种代表农药质谱图示例。表2给出来GC-Q-Orbitrap电子身份数据库中600多种农药清单。

表1 GC-Q-Orbitrap 5种农药化合物电子身份证示例(不含质谱图、化学式)

表2 GC-Q-Orbitrap检测的600多种农药清单

图6表示本发明提出的农药检测电子化方法中，一次制备样品，GC-Q-Orbitrap技术共可筛查600多种农药；取消了标准品做参比，而凭电子标准定性鉴定，实现了以电子身份证代替实物标准，同时也实现了从靶向检测向非靶向筛查的跨跃式发展。节省了资源，减少了污染，提高了分析速度，完全达到了绿色发展、环境友好和清洁高效的要求。

实施例1

结球甘蓝中600多种农药GC-Q-Orbitrap筛查和确证技术实施实例，包括如下步骤；

1、样品前处理技术的具体步骤：

1.1结球甘蓝样品取可食部分切碎，混匀，密封，标明标记；

1.2称取10g结球甘蓝样品(精确至0.01g)，于100mL离心管中，加入40mL 1％醋酸乙腈，用高速匀浆机10000r/min，匀浆提取1min，加入1g氯化钠，4g无水硫酸镁，振荡10min，在4200r/min下离心5min，取上清液20mL，在40℃水浴中旋转蒸发浓缩至约1mL，待净化。

1.3使用CarbonNH2柱，在Carbon/NH2柱中加入约2cm高无水硫酸钠。先用5mL乙腈+甲苯(3+1，v/v)淋洗SPE柱，并弃去流出液，当液面到达硫酸钠的顶部时，迅速将样品浓缩液转移至SPE柱中，下接新鸡心瓶接收。再每次用2mL乙腈+甲苯(3+1，v/v)洗涤样液瓶三次，并将洗涤液移入SPE柱中。在柱上连接50mL贮液器，用25mL乙腈+甲苯(3+1，v/v)洗脱农药及相关化学品，合并于鸡心瓶中，并在40℃水浴中旋转浓缩至约0.5mL。

1.4将浓缩液置于氮气下吹干，用1mL乙酸乙酯定容，经0.22μm滤膜过滤后，供GC-Q-Orbitrap检测。

2、GC-Q-Orbitrap操作条件

色谱条件：气相色谱柱为TG-5SILMS，30m×0.25mm(i.d.)×0.25μm质谱专用柱。程序升温过程：40℃保持1min，然后以30℃/min程序升温至130℃，再以5℃/min升温至250℃，再以10℃/min升温至300℃，保持5min；载气：氦气，纯度≥99.999％，流速1.2mL/min；进样口类型：PTV；进样量：1μL；进样方式：程序升温进样，不分流时间1.5min。

质谱条件：EI源电压：70eV；离子源温度：230℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟：4min。扫描方式：Full MS；质量扫描范围50-600m/z，分辨率60,000FHWM(200m/z)；环氧七氯用于调整保留时间；通过TraceFinder(Version.4.0)对质谱检测结果采集与处理；获得结球甘蓝的在指定色谱质谱条件下的色谱图和质谱图,提取色谱图中的所有保留时间及其对应的精确质量数，建立所有保留时间对应的结球甘蓝中农药的电子身份证。

3、结球甘蓝中农药残留筛查

在全扫描模式下测定样品溶液，将筛查结果与GC-Q-Orbitrap电子身份数据库进行比对，得出农药检出情况。依次将结球甘蓝中农药的电子身份证与电子身份数据库中每个农药化合物的电子身份证比较,如果(ΔT≤0.15并且ΔP≤10％),则记录该农药化合物，如果(ΔT≤0.15并且10％<ΔP≤30％)，则通过质谱图中质谱峰的高度和重合度确定度判断是否包括该农药化合物,否则进入下一个结球甘蓝中农药的电子身份证进行比较；检测完成，显示结球甘蓝样品溶液中所含农药化合物的信息。

某省会城市结球甘蓝样品中GC-Q-Orbitrap筛查结果

采集某省会城市市售结球甘蓝样品12个，应用GC-Q-Orbitrap技术进行600多种农药残留筛查，GC-Q-Orbitrap技术检出12种农药残留，共计32频次，涉及样品12个，具体结果见表3。

表3某地区结球甘蓝样品中GC-Q-Orbitrap筛查结果

实施例2

番茄中600多种农药(如前述说明的农药)GC-Q-Orbitrap筛查和确证技术实施实例。

样品前处理步骤、GC-Q-Orbitrap操作条件和样品中农药残留筛查过程均参照实施例1。

某省会城市番茄样品中GC-Q-Orbitrap筛查结果：采集某省会城市市售番茄样品16个，应用GC-Q-Orbitrap技术进行600多种农药残留筛查，GC-Q-Orbitrap技术检出16种农药残留，共计45频次，涉及样品15个，具体结果见表4。

表4某地区番茄样品中GC-Q-Orbitrap筛查结果

实施例3

葡萄中600多种农药(如前述说明的农药)GC-Q-Orbitrap筛查和确证技术实施实例。

样品前处理步骤、GC-Q-Orbitrap操作条件和样品中农药残留筛查过程均参

照实施例1。

某省会城市葡萄样品中GC-Q-Orbitrap筛查结果：采集某省会城市市售葡萄样品16个，应用GC-Q-Orbitrap技术进行600多种农药残留筛查，GC-Q-Orbitrap技术检出21种农药残留，共计73频次，涉及样品16个，具体结果见表5。

表5某地区葡萄样品中GC-Q-Orbitrap筛查结果

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。