一种增强携带CAR基因慢病毒感染人T细胞效率的新方法

摘要

本发明涉及一种增强携带CAR基因慢病毒感染人T细胞效率的新方法。CAR‑T技术被认为是最有可能治愈肿瘤的技术，尽管已经有了突破性的进展，然而在CAR‑T细胞制备方面仍存在一些瓶颈问题未解决，如T细胞的天然免疫反应使携带CAR基因的慢病毒感染T细胞效率低，这使得CAR‑T细胞制备效率低，成本高。针对如何提高携带CAR基因慢病毒感染T细胞效率的问题，申请人进行了一系列的实验及改进，发现用富马酸二甲酯(DMF)处理T细胞可以显著提高CAR慢病毒感染效率。本发明对大大提高CAR‑T细胞的制备效率，缩短CAR‑T细胞体外扩增的时间，降低CAR‑T疗法生产成本等方面具有指导意义和应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫治疗领域，具体的，本发明涉及一种增强携带嵌合抗原受体(CAR)基因慢病毒感染人T细胞效率的新方法。

背景技术

肿瘤免疫治疗是通过提高机体自身抗肿瘤免疫能力来杀灭肿瘤细胞的一种治疗方法，是继手术治疗、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗技术手段。基于免疫疗法在肿瘤治疗中取得的巨大成功，2013年Science杂志将肿瘤免疫治疗评为年度十大突破首位。嵌合抗原受体修饰的T细胞(Chimeric Antigen Receptor modified T cell，CAR-T)免疫疗法是继淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、细胞毒T细胞(CTL)之后的第五代过继细胞免疫治疗。它是将识别肿瘤抗原的单链抗体(ScFv)序列和T细胞活化序列基因重组后，体外转导入患者外周血分离纯化的T细胞，这些“胞，这武装的T细胞”输入患者体内可直接识别并杀死肿瘤细胞。

与传统自体免疫细胞疗法相比CAR-T有许多优势：(1)靶向性：依靠肿瘤特异性单链抗体或配体识别，使治疗具有靶向性；(2)高效持续性：文献报道1个CAR-T最多可杀死1000个靶细胞。2011年New Engl J Med报道CAR-T在体内增殖高达1000倍，持续存活达1年之久；(3)肿瘤靶点范围广：CAR既可以识别肿瘤蛋白抗原，又可识别糖脂类抗原；(4)无MHC限制：CAR-T细胞识别肿瘤细胞不受MHC限制，可克服肿瘤免疫逃逸。目前，CAR-T细胞技术在血液肿瘤的治疗中已取得巨大成功。美国FDA于2017年先后批准两款CAR-T细胞产品上市，分别为诺华公司的Kymriah(tisagenlecleucel)，主要用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)儿童和青少年患者，此为人类历史上首款CAR-T细胞疗法产品；Kite制药的Yescarta(axicabtagene ciloleucel)，用于治疗罹患特定类型的大B细胞淋巴瘤成人患者，此为首款针对特定非霍奇金淋巴瘤的CAR-T疗法。鉴于目前取得的巨大进展，CAR-T被认为是最有可能治愈肿瘤的技术，是未来肿瘤免疫治疗的发展方向。

尽管CAR-T技术已经有了突破性的进展，然而在CAR-T细胞制备方面仍存在一些瓶颈问题未解决，如T细胞的天然免疫反应使携带CAR基因的慢病毒感染T细胞效率低，这使得CAR-T细胞制备效率低，成本高。针对如何提高携带CAR基因慢病毒感染T细胞效率的问题，申请人进行了一系列的实验及改进，发现用富马酸二甲酯(DMF)处理T细胞可以显著提高CAR慢病毒感染效率。DMF是一种NF-κB的激活抑制剂，可以发挥免疫调节和神经保护作用，并且在2013年该化合物被FDA批准为治疗多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)的口服药。本发明对大大提高CAR-T细胞的制备效率，缩短CAR-T细胞体外扩增的时间，降低CAR-T疗法生产成本等方面具有指导意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增强携带CAR基因慢病毒感染人T细胞效率的方法，具体步骤为：

(1)获取人T细胞；

(2)用含CAR基因的慢病毒感染T细胞，获得表达特异性CAR的CAR-T细胞；

在含CAR的慢病毒感染T细胞前和/或后使用DMF处理T细胞。

优选的，T细胞为原代T细胞。

优选的，在含CAR的慢病毒感染T细胞前0-24小时即开始使用DMF处理T细胞。

更优选的，在含CAR的慢病毒感染T细胞前0-4小时开始使用DMF处理T细胞。

优选的，在含CAR的慢病毒感染T细胞后持续使用DMF处理T细胞，处理时间不少于18小时。更优选的，在含CAR的慢病毒感染T细胞后持续2-18小时使用DMF处理T细胞。

进一步，DMF的浓度为不大于200μM，优选的，DMF的浓度为25-100μM，更优选的，DMF的浓度为50μM。

进一步，DMF与其他慢病毒感染增强剂联用提高含CAR基因的慢病毒感染T细胞效率。优选的，慢病毒感染增强剂联选自Polybrene、RetroNectin、HiTransG感染增强液、英格恩公司EnvirusTM系列慢病毒感染增强剂中的一种或几种。

优选的，DMF与Polybrene联用。

优选的，Polybrene的浓度为1-10μg/ml，DMF的浓度为25-100μM；更优选的，Polybrene的浓度为6μg/ml，DMF的浓度为50μM。

T细胞来源于健康人或患者外周血单个核细胞(PBMC)。

一种增强携带CAR基因慢病毒感染T细胞效率的方法，具体步骤为：

(1)从健康人或患者外周血分离PBMC；

(2)纯化获得CD3⁺T细胞；

(3)通过免疫磁珠激活T细胞并培养48-72小时；

(4)激活的T细胞与免疫磁珠分离，加入DMF处理4-12小时；

(6)用含CAR的慢病毒感染T细胞，同时加入Polybrene和DMF，混匀；

(7)感染2-18小时后换液，继续培养5-10天，获得表达CAR的CAR-T细胞。

在含CAR的慢病毒感染T细胞前和/或后使用DMF处理T细胞。

本发明提供的增强慢病毒感染T细胞效率的方法用于制备免疫治疗试剂中的应用。

所述免疫治疗的疾病为与人体免疫系统相关的疾病，包括但不限于治疗良性肿瘤、恶性肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病、过敏性疾病等。

常见的与自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺机能亢进、青少年糖尿病、原发性血小板紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎以及许多种皮肤病、慢性肝病等。

肿瘤包括但不限于：肺癌、骨癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、卵巢癌、皮肤癌、淋巴癌、白血病、结肠癌、甲状腺癌、宫颈癌、头颈癌、肉瘤、神经胶质瘤、胆囊癌等。

附图说明

图1是DMF处理人T细胞22小时CCK-8检测结果图；

图2是DMF处理与否对CD19-CAR慢病毒感染健康人T细胞制备的CAR-T阳性率的影响图(MOI＝20)；

图3是DMF处理与否对CD19-CAR慢病毒感染健康人T细胞制备的CAR-T阳性率的影响图(MOI＝10)；

图4是DMF处理与否对CD19-CAR慢病毒感染骨髓瘤患者T细胞制备的CAR-T阳性率的影响图(MOI＝5)；

图5是DMF处理与否对CD19-CAR慢病毒感染淋巴瘤患者T细胞制备的CAR-T阳性率的影响图(MOI＝5)；

图6是DMF处理与否对CD19-CAR慢病毒感染健康人T细胞制备的CAR-T阳性率的影响图(MOI＝5)；

图7是DMF处理与否对BCMA-CAR慢病毒感染健康人T细胞制备的CAR-T阳性率的影响图(MOI＝10)；

图8是无DMF预处理T细胞对慢病毒感染T细胞效率影响图

图9是感染后DMF处理与否对慢病毒感染T细胞效率影响图

图10是感染后DMF处理时间对慢病毒感染T细胞效率影响图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1人PBMC的分离与冻存

1、准备实验试剂：淋巴细胞分离液(室温≈20℃)；无菌生理盐水(预热至37℃)；细胞冻存液(预冷至2-8摄氏度)。

2、将临床采集的人外周血样品移至一个15ml无菌离心管内，旋紧盖子，调整离心机离心力至800g、离心降速设为最低，将血样室温离心20分钟。

3、离心结束后取出离心管，避免剧烈晃动或颠倒离心管，将上层浅黄色血清层移至一个新的无菌离心管中(56摄氏度热灭活1小时后，将血清转移至-80摄氏度冰箱备用)；然后向下层的红色外周血细胞层加入等体积的生理盐水，旋紧离心管盖，轻轻上下颠倒混匀。

4、取出淋巴细胞分离液，并上下颠倒数次，充分混匀。

5、首先向15ml离心管中加入5ml淋巴细胞分离液，然后小心将上述第2步中用生理盐水稀释后的血样沿管壁缓慢添加至淋巴细胞分离试剂的上层，避免分离试剂与血样的混合。

6、将离心机的离心力设置为800g，转速下降速度设为最低，温度设为20摄氏度，离心20分钟。

7、离心结束后，轻轻的取出离心管，避免剧烈晃动或上下颠倒离心管，将处于中间的白色单核细胞层吸入一个新的无菌离心管中，加入等体积的生理盐水后，旋紧离心管盖，上下颠倒混匀，800g离心5分钟，离心结束后，将上层液体全部吸出，然后加入5ml生理盐水，轻轻混匀后，取部分细胞悬液进行计数，并计算细胞总数，800g离心5分钟。

8、离心结束后，将上层液体全部吸出，根据上述第6步细胞计数结果，按照细胞密度为1×10^7cells/ml加入细胞冻存液，轻轻吹打离心管底部的细胞团，将细胞悬液转移至新的无菌细胞冻存管中。立即将冻存管移至4℃预冷的梯度降温盒中，并将梯度降温盒置于-80℃超低温冰箱内过夜，第二天将细胞冻存管放入液氮中保存备用。

实施例2T细胞的复苏、纯化与激活

1、配制T细胞培养基：90％X-VIVO 15，10％BI胎牛血清，并加入IL-2、IL-15、IL-7，令其终浓度分别为200U/ml、5ng/ml、5ng/ml。

2、取一支冻存的PBMC，于37摄氏度水浴锅内化开后加入10ml复温的T细胞培养基中离心，300g，8min。

3、弃上清，用3ml T细胞培养基重悬细胞，加入DNaseI使其工作浓度为100μg/ml，votex，于细胞培养箱中静置15min。

4、用40μm细胞筛网过滤，计数过滤后的细胞。

5、将细胞悬液离心，300g，8min。

6、T细胞纯化：依据EasySep^TM>

7、T细胞计数，离心，300g，8min。

8、T细胞激活：依据Human T-Expander CD3/CD28试剂盒的操作说明将相应体积的Dynabeads加入纯化后的T细胞，继续培养72小时。

实施例3CCK-8检测DMF对T细胞增殖的影响

1、T细胞与Dynabeads分离：将激活72小时的T细胞转移至15ml离心管，充分吹打混匀。将离心管置于EasySep^TM磁极，室温静置3min，将细胞悬液转移至一个新的15ml离心管中，计数。

2、将T细胞按1×10^5cells/100μl/well接种于96孔板中，分别给予不同浓度DMF处理(0，25μM，50μM，100μM，150μM，200μM)，每种浓度设3个复孔，继续培养22小时。

3、每孔加入CCK-8 10μl，吹打混匀。将培养板在培养箱内孵育1-4小时，酶标仪测定在450nm处的吸光度。

4、计算不同浓度下的抑制率。

结果如图1所示，50μM DMF下的处理对T细胞增殖没有产生明显的抑制，但随浓度增加DMF出现了显著的抑T细胞增殖效应，所以后续实验都沿用50μM殖效这一处理条件。

实施例4慢病毒感染制备CAR-T细胞

1、Day1：复苏PBMC细胞、纯化CD3⁺T细胞并激活培养。

2、Day3：感染前一天用RetroNectin稀释液(1mg/ml RetroNectin 1.2μl+48.8μl1×PBS)包被96孔细胞培养板，每孔50μl。将处理好的细胞培养板4摄氏度避光，静置过夜。

3、Day4：T细胞激活72小时后，感染CAR慢病毒：

Step1，将激活的T细胞与Dynabeads分离，计数。按2×10^5cells/200μl/well接种于96孔细胞培养板中。对应孔加入DMF(50μM培养)，置于细胞培养箱中继续培养4小时。

Step2，将RetroNectin处理过的96孔板取出，吸弃RetroNectin，加入2％BSA/PBS100μl/well，室温静置30分钟。用1×PBS 100μl/well清洗孔板两遍，获得RetroNectin包被的96孔细胞培养板。

Step3，DMF预处理4小时后，将96孔细胞培养板离心，200g，32℃，10min，ACC4，DEC1，弃上清。

Step4，按照MOI＝20，计算所需要的病毒量。计算公式如下：所需病毒量(mL)＝(MOI×细胞数量)/病毒滴度。向对应孔中加入上述计算所得的病毒量，同时在对应的孔中加入Polybrene(6μg/ml)和DMF(50μM)，用移液器轻轻吹打混匀。用配置好的慢病毒感染液(无血清)重悬细胞沉淀，然后转移至RetroNectin处理过的细胞培养板中，使用封口膜将培养器皿密封。

Step5，离离心96孔细胞培养板，32℃，1000g，2h，ACC4，DEC1，随后置于细胞培养箱中继续培养18小时。

4、Day5：CAR慢病毒感染18小时后使用封口膜将培养器皿密封离心，32℃，200g，10min，ACC4，DEC1。吸弃上清，用200μl新鲜培养基(含10％血清)重悬细胞沉淀，置于细胞培养箱中继续培养。

5、Day6：感染48小时后，将感染慢病毒的CAR-T细胞从RetroNectin包被的孔中移出，转移至新的孔中继续培养观察。

6、Day7-Day9：每天半量换液，正常培养传代。

7、Day10：感染6天后流式细胞术检测CAR-T表达的阳性率。

结果如图2所示，DMF未处理组CAR-T阳性率为28.74％，DMF处理组CAR-T阳性率为33.68％，感染效率提高了5％。提示DMF的处理可以增强携带CAR基因慢病毒的侵染效率。

将MOI调整为10重复上述操作，结果如图3所示，DMF的处理可以将CAR-T阳性率提高约10％，进一步证实在不同的MOI值下，DMF的处理都可显著提高CAR慢病毒的感染效率，且MOI较低时这种现象更明显。

实施例5不同类型的CAR慢病毒感染不同来源的T细胞

实验步骤同实施例4。

结果如图4-7所示，图4-6均为CD19-CAR慢病毒感染(MOI＝5)，图7为BCMA-CAR慢病毒感染(MOI＝10)，T细胞分别来自骨髓瘤患者、淋巴瘤患者和两例健康供者的PBMC。如图4所示，应用CD19-CAR慢病毒感染来源于骨髓瘤患者的T细胞。Polybrene作为一种广泛应用的慢病毒感染增强剂可将感染效率从6.83％提高到11.61％，而DMF单独应用即可获得13.18％CAR阳性表达率，与Polybrene联用后更是将阳性率提升至18.53％，证实DMF处理可以显著提高CAR慢病毒的感染效率。如图5所示，我们在淋巴瘤患者来源的T细胞中重复了上述实验，结果显示Polybrene处理组阳性率为6.94％，DMF单独应用阳性率提高了近一倍为12.73％，而且与Polybrene联用后感染效率可进一步升高。如图6所示，在健康供者的T细胞中也可以获得相似的研究结果。DMF单独应用可以获得与Polybrene处理组相似的感染效率，二者联用后与未处理组相比，CAR-T阳性率可提高近2.6倍。如图7所示，为了验证这一研究发现的普适性，我们选择BCMA-CAR慢病毒去感染另一健康供者来源的T细胞。结果发现，单独感染病毒组阳性率仅为7.23％，应用DMF或Polybrene处理细胞可显著提高慢病毒感染效率，阳性率分别为11.83％和10.25％，但二者联用可将阳性率从7.23％提升到17.26％。提示：携带CAR基因的慢病毒感染人T细胞过程中，加入DMF或DMF+Polybrene复合物可显著增强CAR病毒的感染效率，且这种效应具有普遍性。这一研究发现对于提高CAR-T细胞的制备效率，缩短CAR-T细胞体外扩增的时间，降低CAR-T疗法生产成本方面具有指导意义和应用价值。

实施例6对DMF处理T细胞进行时间优化

实验步骤如实施例4。

本次用健康供者来源的T细胞感染BCMA-CAR慢病毒(MOI＝10)，但对DMF的处理时间进行优化。

实验一：无DMF预处理4小时，仅在感染慢病毒时加入DMF并持续处理细胞18小时。

结果如图8，DMF未处理组阳性率为9.39％，DMF处理组为11.08％，感染效率仅增加了1.6％，提示：仅在感染CAR病毒时加入DMF是不能有效提高慢病毒的感染效率的，感染前4小时应用DMF预处理T细胞对于提高CAR阳性率是必要的。

实验二：感染前应用DMF预处理T细胞4小时，感染时一组继续用DMF处理细胞18小时，另一组撤掉DMF。

结果如图9，Polybrene处理组感染效率为13.70％，感染后未加DMF处理组感染效率为17.50％，略高于Polybrene处理组。而感染后继续加DMF处理组感染效率最高，可以达到29.57％，是Polybrene处理组的2.1倍。提示：DMF发挥最佳的增强CAR慢病毒感染效率的作用，既需要感染前的4小时预处理，也需要感染后的持续给药。

实验三：在实验二的基础上，对感染后DMF的处理时间进行优化，共设计了三个时间点，分别是感染后持续给药2小时、10小时、18小时，比较不同时间点的感染效率是否有差别。

结果如图10，感染后持续给药2小时、10小时、18小时的感染效率分别为17.43％，23.53％和26.88％，均高于Polybrene处理组的12.04％。提示：随DMF处理时间的延长，感染效率逐渐增加，直至18小时达到最高，是Polybrene处理组的2.2倍。根据上述实验结果我们明确了最佳的实验方案为：感染前先用DMF预处理T细胞4小时，感染后继续加药18小时。