携带HIF-1α的慢病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞后对其成骨基因表达的影响

摘要

目的：提取人低氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α）的基因片段，构建携带HIF-1α的慢病毒，感染大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），通过实时荧光定量PCR检测BMSCs中成骨因子表达情况。
　　方法：从Hela细胞中提取总RNA，逆转录生成cDNA。设计引物，以cDNA为模板，PCR扩增HIF-1α基因，PCR产物纯化后，经双酶切（BamHI、 PspXI）后克隆至Lv-eGFP慢病毒质粒，转化大肠杆菌感受态细胞DH-5α，PCR方法筛选出基因重组阳性菌，抽提质粒获得Lv-HIF-1α-eGFP,对HIF-1α基因进行测序鉴定。用构建成功的HIF-1α慢病毒质粒转染293Ta细胞，转染48h后收集富含慢病毒的细胞上清液。将病毒原液梯度稀释，加入到准备好的293Ta细胞中，培养48h后倒置荧光显微镜下观察带荧光的细胞数，计算出病毒滴度。取SD大鼠股骨及胫骨的骨髓，使用直接贴壁法分离培养大鼠BMSCs，通过形态学观察及流式细胞仪检测细胞表面标记物CD90、CD105对第3代BMSCs进行鉴定。将病毒原液感染生长状态良好的BMSCs，72h后倒置荧光显微镜下观察转染效率。细胞实验分为3组：用携带HIF-1α的慢病毒感染BMSCs作为实验组（简称HIF-1α-eGFP-BMSCs组）、用不携带HIF-1α的慢病毒感染BMSCs作为空载体组（简称eGFP-BMSCs组）、不进行处理的BMSCs作为空白对照组（简称BMSCs wildtype组）。各组分别于感染后1d、4d、7d、14d提取细胞总RNA，后反转录生成cDNA，设计引物，使用实时荧光定量PCR法检测BMSCs中成骨基因BMP-2、OCN、OPN、ALP的表达水平。
　　结果：HIF-1α基因片段测序及载体质粒的酶切产物电泳结果表明Lv-HIF-1α-eGFP慢病毒载体质粒构建成功。HIF-1α慢病毒液转染293Ta细胞48h后，用孔稀释计数法计算出病毒滴度为5.0×107TU/ml。用流式细胞仪对大鼠BMSCs细胞表面标记物CD90及CD105进行检测，其阳性率分别为99.8％、97.3%。实时荧光定量PCR法结果表明实验组BMSCs中成骨基因BMP-2、OCN、OPN、ALP表达水平较空载体组显著提高（P＜0.05）：
　　（1）实验组大鼠BMSCs中BMP-2的表达水平在转染后1d、4d、7d、14d分别为空载体组的2.96倍、6.85倍、6.48倍、6.17倍；
　　（2）实验组大鼠BMSCs中OCN的表达水平在转染后1d、4d、7d、14d分别为空载体组的2.50倍、5.33倍、7.13倍、7.07倍；
　　（3）实验组大鼠BMSCs中OPN的表达水平在转染后1d、4d、7d、14d分别为空载体组的2.44倍、4.98倍、6.27倍、7.32倍；
　　（4）实验组大鼠BMSCs中ALP的表达水平在转染后1d、4d、7d、14d分别为空载体组的2.27倍、4.43倍、5.81倍、5.38倍。
　　结论：成功构建了携带HIF-1α基因的慢病毒载体，大鼠BMSCs培养成功。携带HIF-1α的慢病毒感染BMSCs后，能明显提高成骨基因BMP-2、OCN、OPN、ALP的表达水平，表明HIF-1α可以提高BMSCs的成骨活性。

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第一章 前 言

第二章 材料与方法

第三章 结果

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

附录1：文献综述

附录2：在读期间发表的论文

附录3：个人简历

致谢