乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122三重荧光定量PCR检测试剂盒

摘要

本发明提供了一种乙型肝炎病毒miR‑3和人肝脏特异性miR‑122三重荧光定量PCR检测试剂盒，其包括乙型肝炎病毒miR‑3的逆转录引物如SEQ ID NO.1所示、荧光探针如SEQ ID NO.2所示、PCR引物如SEQ ID NO.3和4所示，还可以进一步包括人肝脏特异性miR‑122的逆转录引物如SEQ ID NO.5所示、荧光探针如SEQ ID NO.6所示、PCR引物如SEQ ID NO.7和8所示，还可以进一步包括内参逆转录引物如SEQ ID NO.9所示、荧光探针如SEQ ID NO.10所示、PCR引物如SEQ ID NO.11和12所示。该试剂盒使用三重荧光定量PCR的方法从微量(100μl)血清或血浆中检测乙型肝炎病毒miR‑3和人肝脏特异性miR‑122的浓度，检测方法特异、高效、灵敏。该试剂盒能够用于乙型肝炎病毒复制情况的监控、抗病毒药物疗效和预后的评估和肝脏损伤的评测，具有重要的临床意义。

说明书

技术领域

本发明涉及生物、医学检测领域，特别涉及一种三重荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122的试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒miR-3是由乙型肝炎病毒基因组编码产生的特异性microRNA,对乙型肝炎病毒的复制具有控制作用。血清或血浆中的HBV miR-3的浓度可以用来评估乙肝病毒复制的情况,同时也能用来评估抗病毒治疗疗效和预后(Xi Yang et al.Hepatitis BVirus-Encoded MicroRNA Controls Viral Replication.Journal of Virology.2017Volume 91 Issue 10 e01919-16)。miR-122是人肝脏细胞特异性表达的microRNA，血清中的miR-122浓度可以用来评测人肝脏细胞由于病毒活动等造成的损伤程度。这两种microRNA都可以作为一种新的生物学指标应用于临床检测，具有重要的临床意义。

从血清中运用荧光PCR检测乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122，目前有染料法和探针法，染料法特异性不如探针法，目前这两种方法都是通过加入的标准化内参Ct值进行相对定量的方法，无法准确定量出具体的分子拷贝数，检测下限和灵敏性都不可知。而且目前已有的方法都是单通道单色检测，每种microRNA需要单独一管进行PCR，检测效率低下。

本发明的microRNA逆转录使用的是茎环法，比现在主流的加尾法特异性强，成本低，同时为三重荧光定量PCR提供了可能。本发明的三重荧光定量PCR在同一个反应管中同时加入乙型肝炎病毒miR-3、人肝脏特异性miR-122和内参的三套引物和三种不同荧光的探针，同时进行荧光定量PCR互不干扰，一管反应可以获得三个结果，比目前的单色荧光定量PCR提高了200％的效率。本发明提供的乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122定量参考品，能够绘制标准曲线并且定量标本中乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122的拷贝数浓度，比目前的相对定量方法更直接客观。

发明内容

本发明的目的是提供一种乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122三重荧光定量PCR检测试剂盒，解决现有技术中microRNA检测试剂盒单色荧光PCR效率低，不能绝对定量血清microRNA分子拷贝浓度的技术问题。

为了实现上述目的，本发明首先提供了乙型肝炎病毒miR-3的引物、探针，包括：

用于逆转录乙型肝炎病毒miR-3采用的茎环法逆转录引物：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAAACGCCG；

用于检测乙型肝炎病毒miR-3的荧光探针：

CACTGGATACGACAAACGCCGCAGA；

乙型肝炎病毒miR-3探针5’端连有荧光基团FAM，3’端连有猝灭基团BHQ1。

用于扩增乙型肝炎病毒miR-3的PCR上游引物：TGCGACTGGATGTGTCTG；

用于扩增乙型肝炎病毒miR-3的PCR下游引物：

CCAGTGCAGGGTCCGAGGT。

优选地，本发明还提供了人肝脏特异性miR-122的引物、探针，包括：

用于逆转录人肝脏特异性miR-122采用的茎环法逆转录引物：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAACA；

用于检测人肝脏特异性miR-122的荧光探针：

CGCACTGGATACGACCAAACACCAT；

人肝脏特异性miR-122探针5’端连有荧光基团Cy5，3’端连有猝灭基团BHQ2。

用于扩增人肝脏特异性miR-122的PCR上游引物：

TCGCCTGGAGTGTGACAATGG；

用于扩增人肝脏特异性miR-122的PCR下游引物：GTGCAGGGTCCGAGGT。

优选地，本发明进一步提供了用于作为内参检测的C.elegans miR-39引物和探针，包括：

用于逆转录内参C.elegans miR-39采用的茎环法逆转录引物：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAGCT；

用于检测内参C.elegans miR-39的荧光探针：

CGCACTGGATACGACCAAGCTGATT；

内参C.elegans miR-39探针5’端连有荧光基团Hex，3’端连有猝灭基团BHQ1。

用于扩增内参C.elegans miR-39的PCR上游引物：

TCGCCTCACCGGGTGTAAATC；

用于扩增内参C.elegans miR-39的PCR下游引物：GTGCAGGGTCCGAGGT。

优选地，本发明进一步提供了用于绝对定量的参考品和标准化内参包括：乙型肝炎病毒miR-3定量参考品：

TGCGACTGGATGTGTCTGCGGCGTTTGTCGTATCCAGTGCACCTCGGACCCTGCACTGG；

乙型肝炎病毒miR-3定量参考品为一段长为59碱基的人工合成DNA序列，根据摩尔分子数计算分子拷贝数稀释而成。该乙型肝炎病毒miR-3定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为5.00E+07copies/ml(A)、5.00E+06copies/ml(B)、5.00E+05copies/ml(C)、5.00E+04copies/ml(D)。

人肝脏特异性miR-122定量参考品：

GCCTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGGTCGTATCCAGTGCGAATACCTCGGACCCTGCAC

人肝脏特异性miR-122定量参考品为一段长为59碱基的人工合成DNA序列，根据摩尔分子数计算分子拷贝数稀释而成。该乙型肝炎病毒miR-3定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为5.00E+07copies/ml(A)、5.00E+06copies/ml(B)、5.00E+05copies/ml(C)、5.00E+04copies/ml(D)。

标准化内参C.elegans miR-39：UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG；

标准化内参C.elegans miR-39为一段长为22碱基的人工合成RNA序列。

优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括microRNA提取试剂：Trizol试剂(购自Invitrogen公司)、小分子RNA吸附柱(购自Magen公司)、洗液1(75％乙醇)、洗液2(85％乙醇)。选择Trizol试剂的方法，强烈的变性蛋白和保护RNA不被降解，然后氯仿萃取出RNA,通过小分子吸附柱纯化出microRNA，操作步骤简单、高效。

优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括2.5×逆转录混合液，包括：125mmol/LTris-HCl(PH 8.3)，125mmol/L KCl,10mmol/L MgCl₂，25mmol/L>

优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括2×DNA聚合酶(Taq酶)混合液，包括：0.05U/μL DNA聚合酶，100mmol/L Tris-HCl(PH 8.5)，100mmol/L KCl,3mmol/L MgCl₂，0.4mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)。

本发明进一步提供了该试剂盒用于检测血清、血浆等未知样本中的乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122浓度的操作步骤，按照microRNA提取、microRNA逆转录、荧光定量PCR的流程，具体详细步骤如下：

步骤1.用5倍于样本体积的Trizol试剂处理血清或血浆样本，并加入内参至25pmol/L，反复吹打混匀至充分溶解，室温静置10分钟。

步骤2.加入与样本等体积的氯仿，振荡15秒后静置3分钟。12000g以上高速离心15分钟，转移上层水相即萃取出的血清或血浆总RNA至1.5ml无RNA酶离心管,并加入等体积异丙醇混匀，室温静置10分钟。

步骤3.将异丙醇处理的RNA加入小分子RNA吸附柱离心过滤，将小分子RNA吸附在柱子上，将大分子RNA滤过并丢弃。用500μL洗液1离心洗涤一次，再用500μL洗液2离心洗涤一次，去除杂质，最后用15μL无RNA酶水离心洗脱小分子RNA吸附柱，获得microRNA。

步骤4.对提取的microRNA进行逆转录：取11.5μL提取的microRNA、8μL的2.5×逆转录混合液和0.5μL的10μmol/L逆转录引物混合液，充分混匀，置于42℃进行逆转录30分钟，再于70℃孵育5分钟灭活逆转录酶，逆转录获得的cDNA置冰盒中备用。

步骤5.三重荧光定量PCR：取5μl逆转录好的cDNA，加入25μl的2×DNA聚合酶混合液、5μl的2μmol/L探针混合液、15μl去离子水，于PCR管内混匀，进行荧光定量PCR反应，反应条件为：95℃3分钟，进入循环：95℃12秒，60℃30秒(检测荧光)，运行45-50个循环结束。

步骤6.分析结果数据，通过标准品拷贝数和Ct值绘制标准曲线，计算获得待测样本中乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122浓度，通过内参Ct值归一化处理结果，消除microRNA提取操作误差。

本发明试剂盒因为采用用于检测乙型肝炎病毒miR-3、人肝脏特异性miR122和内参的探针都具有很好的特异性，应用本发明提供的试剂盒，可以对血清、血浆等未知样本中的乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR122的浓度进行快速、精准测定，特异性好，三重荧光PCR能够在同一管中同时检测出乙型肝炎病毒miR-3、人肝脏特异性miR122和内参，比现有的单色荧光PCR方法效率提高了200％。进一步地，因为本发明试剂盒加入标准化内参，既可以有效监控假阴性的存在，还可以通过内参Ct值校正不同血清样本microRNA提取过程和PCR过程中产生的实验操作误差，对实验结果的重复性和稳定性有明显改善。总之，本试剂盒在很大程度上简化了实验的步骤，降低了成本，而且检测效率有了很大的提高。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为本发明提供的试剂盒乙型肝炎病毒miR-3定量参考品A(5.00E+07copies/ml)、B(5.00E+06copies/ml)、C(5.00E+05copies/ml)和D(5.00E+04copies/ml)的扩增曲线图；

图2为本发明提供的试剂盒乙型肝炎病毒miR-3荧光定量PCR检测定量分析的标准曲线图；

图3为本发明提供的试剂盒人肝脏特异性miR122定量参考品A(5.00E+07copies/ml)、B(5.00E+06copies/ml)、C(5.00E+05copies/ml)和D(5.00E+04copies/ml)的扩增曲线图；

图4为本发明提供的试剂盒人肝脏特异性miR122荧光定量PCR检测定量分析的标准曲线图；

图5为本发明提供的试剂盒检测实验中，在同一管中同时扩增乙型肝炎病毒miR-3、人肝脏特异性miR122和内参的三重荧光定量PCR扩增曲线结果图；

图6为样本的检测中10个正常人血清标本的miR-3和内参扩增曲线图；

图7为样本的检测中10个乙型肝炎病毒阳性血清标本的乙型肝炎病毒miR-3扩增曲线图；

图8为样本的检测中10个乙型肝炎病毒阳性血清标本的人肝脏特异性miR-122扩增曲线图；

图9为样本的检测中10个乙型肝炎病毒阳性血清标本的内参扩增曲线图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步阐述：

实施例1.microRNA提取

(1)取100μl血清/血浆加入1.5ml离心管，每管加入0.5ml的Trizol试剂，枪头反复吹打混匀直至蛋白完全溶解，每管加入5nmol/L的内参5μl，混匀，室温放置10分钟。

(2)每管加入100μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

(3)4℃，12000×g离心15分钟，吸取0.3ml上清至新的1.5ml离心管中，并加入0.3ml异丙醇，混匀，室温静置10分钟。

(4)把小分子RNA吸附柱装在2ml收集管中，转移所有RNA异丙醇混合液至小分子RNA吸附柱中，8000×g离心1分钟。

(5)倒弃滤液，装回柱子，加入0.5ml洗涤液1至柱中，8000×g离心1分钟。倒弃滤液，装回柱子，加入0.5ml洗涤液2至柱中，12000×g离心3分钟。

(6)将柱子转移至无RNA酶的1.5ml离心管中，加入15μl无RNA酶水至柱中，静置2分钟，12000×g离心1分钟，丢弃柱子，microRNA置冰盒中备用。

实施例2.microRNA逆转录

(1)取2.5×逆转录混合液8μl、10μmol/L的逆转录引物混合液0.5μl加入0.2ml无RNA酶的PCR薄壁管中。(其中10μmol/L逆转录引物混合液为miR-3、miR-122和C.elegansmiR-39逆转录引物的混合物，三者的浓度均为10μmol/L)

(2)取提取好的microRNA 11.5μl加入上述混合液中，吹打混匀。

(3)放入PCR仪进行逆转录，条件为：42℃30分钟，70℃5分钟。获得的cDNA置冰盒中备用。

实施例3.三重荧光定量PCR

(1)取2×PCR混合液25μl、2μmol/L探针混合液5μl、去离子水15μl加入0.2ml的8联PCR管中。(其中2μmol/L探针混合液为miR-3、miR-122和C.elegans miR-39探针的混合物，三者的浓度均为2μmol/L)

(2)每管加入5μl逆转录好的cDNA，混匀。

(3)将PCR反应管放入荧光定量PCR扩增仪，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度

(4)荧光检测通道的选择：通过软件选择FAM通道检测miR-3，选择HEX检测内参，选择Cy5通道检测miR-122。

(5)荧光定量PCR反应条件为：95℃3分钟，进入循环：95℃12秒，60℃30秒(检测荧光)，运行45-50个循环结束。

(6)结果分析：反应结束后，仪器自动保存结果。在相应的通道，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时，所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本乙型肝炎病毒miR-3的4个浓度梯度定量参考品扩增曲线(见图1)，获得Ct值绘制标准曲线(见图2)，同时根据人肝脏特异性miR122的4个浓度梯度定量参考品扩增曲线(见图3)，获得Ct值绘制标准曲线(见图4)，每个标本通过三重荧光PCR扩增可以在同一个反应管内同时获得乙型肝炎病毒miR-3、人肝脏特异性miR122和内参三条扩增曲线(见图5)，软件可以自动求得各样本的定值结果。最后通过内参Ct值校正结果(校准浓度＝检测浓度/2^-△内参Ct)。如果样本扩增曲线呈S型，有Ct值且定值结果≥500copies/ml，报告具体拷贝数浓度；如果定值结果≤500copies/ml，报告结果为低于检测下限；如果样本扩增曲线平直，无Ct值显示或无定值结果显示，可以判为阴性。凡内参无扩增曲线的数据为无效，应复查获得有效数据才能报告结果。

实施例4.检测10例正常人和10例乙型肝炎病毒阳性血清标本的乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122浓度。

收集10例正常人和10例乙型肝炎病毒阳性血清标本，各取100μL，按照上述实施例1、2、3所描述的方法检测乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122，10例正常人乙型肝炎病毒miR-3扩增曲线平直，无Ct值，检测乙型肝炎病毒miR-3均为阴性(见图6)。10例乙型肝炎病毒阳性血清标本检测乙型肝炎病毒miR-3均为阳性(见图7)，同时可见人肝脏特异性miR-122的阳性扩增曲线(见图8)。所有标本均检测出内参，可见内参扩增曲线位置集中(图9)，这是试剂盒操作标准化的标志。最后通过内参Ct值校正结果。

序列表

<110>中南大学湘雅二医院

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