环糊精在治疗脆性X综合征中的应用

摘要

本发明涉及环糊精在治疗脆性X综合征中的应用，公开了甲基‑β‑环糊精在治疗脆性X综合征中的应用。利用Fmr1基因敲除小鼠模型，发现甲基‑β‑环糊精可以清除细胞膜上的胆固醇，有效调节脂筏中信号转导功能，并且腹腔注射后可以显著改善脆性X综合征模型动物的行为学症状。本发明为治疗脆性X综合征提供了新的药效物质和作用靶点，这为环糊精在医药上单独应用或联合应用提供可靠的依据。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及环糊精在治疗脆性X综合征中的应用。

背景技术

脆性X综合征(Fragile X syndrome,FXS)是临床最常见的遗传性智力低下症，主要表现为中重度智力低下，并伴随有明显的语言行为障碍。据保守估计[1]，我国至少有40万FXS病人，因此探索其药物治疗途径是社会和临床急需解决的一个重要课题。

FXS是一种单基因遗传疾病，发病机制是由于Fmr1基因的CGG重复序列过多导致FMRP蛋白缺失而引起[2]。目前广泛接受的观点认为[3]，脆性X综合症中失去FMRP时，代谢型谷氨酸受体(metabolic glutamate receptor,mGluR)依赖性翻译过表达，引起突触后谷氨酸AMPA受体从细胞膜向胞浆转移加强，在电生理学上表现为长时程抑制(long-termdepression,LTD)过度增强，导致FXS出现发育迟滞、癫痫发作和智力障碍等典型临床症状。

细胞膜上脂筏在AMPA受体的内吞过程中起重要作用，一方面能够募集蛋白，使相关蛋白更易相互作用；另一方面也把各个蛋白隔离开来，使它们在正常情况下不被激活。胆固醇是形成细胞膜脂筏的重要结构，其通过与一些脂蛋白或磷脂相互作用，参与膜受体激活后的细胞膜凹陷或重建[4]。

环糊精类药物是由淀粉经酶解后经葡萄糖转糖苷作用而成的环状低聚糖化合物。形状如截断的锥形，外表面有亲水结构并通过(α1→4)连接了α-D-吡喃葡萄糖单元和一个亲脂性的内部空腔。在医药领域，环糊精的价值不断涌现，主要体现在药物运输方面，可作为药物载体起封装的间接作用。目前仍未见环糊精在治疗脆性X综合征方面的相关报道。因此，将环糊精引入到治疗脆性X综合征中(单独或多药联合治疗)，具有重大现实意义。

发明内容

本发明提供一种环糊精在治疗和/或预防Fmr1基因缺陷导致的疾病中的应用。

本发明的另一实施方案提供环糊精在治疗和/或预防脆性X综合征的中的应用。

本发明提供治疗Fmr1基因缺陷或者脆性X综合征的药物新靶标，以细胞膜上脂筏作为治疗Fmr1基因缺陷或脆性X综合征的药物新靶标，具体调节分子包括胆固醇和小窝蛋白caveolin-1。

本发明的另一实施方案提供一种用于治疗和/或预防Fmr1基因缺陷或者脆性X综合征的药物，其特征在于以环糊精作为有效成分。任选与其他治疗和/或预防脆性X综合征的药物联合使用。所述其他治疗和/或预防脆性X综合征的药物优选中药、植物药提取物、有效部位或有效成分、小窝蛋白caveolin-1的小分子化合物、核酸类如RNAi、多肽类或蛋白质类药物。

环糊精的给药方式包括腹腔注射、皮下注射和/或口服给药。给药剂量优选125mg/kg或250mg/kg。

环糊精与小窝蛋白caveolin-1的干扰RNA联合，用于治疗脆性X综合征。

本发明所述所述环糊精包含α环糊精家族(天然、随机甲基化-α-环糊精)、β环糊精家族(天然、甲基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、三甲基-β-环糊精)和γ环糊精家族(天然、随机甲基化-γ-环糊精)。优选甲基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、三甲基-β-环糊精中的一种或几种。

本发明公开了甲基-β-环糊精在治疗脆性X综合征中的应用，其目的在于将环糊精引入到脆性X综合征的治疗中，采用单独或多药联合对动物模型Fmr1基因敲除小鼠进行治疗，发现甲基-β-环糊精可以清除细胞膜上胆固醇，有效调节脂筏中信号转导功能，并且腹腔注射后可以显著改善治疗脆性X综合征模型动物的行为学症状。本发明为治疗脆性X综合征提供了新的药效物质和作用靶点，这为环糊精在医药上的新应用提供可靠的依据。

附图说明

图1 Fmr1基因敲除小鼠的海马脑区中胆固醇过度积累。图A，正常小鼠和基因敲除小鼠的血清中总胆固醇和游离胆固醇的含量。图B，正常小鼠和基因敲除小鼠的海马组织中总胆固醇和游离胆固醇的含量。图C，激光共聚焦观察海马脑区中胆固醇染色的情况。

图2甲基-β-环糊精干扰DHPG诱导的AMPA受体亚基GluA2转运和磷酸化。图A，免疫印迹检测海马脑片中细胞膜和细胞浆中的GluA2水平。图B，甲基-β-环糊精(Mβ-CD)促进基因敲除小鼠中DHPG诱导的GluA2向胞膜分布，但是可被胆固醇逆转。图C，Mβ-CD对基因敲除小鼠中的胞浆GluA2有轻微降级作用。图D，免疫印迹检测海马脑片中总的pGluA2、GluA2、pCaveolin1和Caveolin1表达水平。图E，Mβ-CD降低DHPG诱导的GluA2磷酸化水平，但可被胆固醇逆转。图F，Mβ-CD消除小窝蛋白Caveolin1的表达，使其磷酸化比例改变。

图3甲基-β-环糊精纠正Fmr1基因敲除小鼠的异常行为。图A，B，C显示旷场实验，Mβ-CD降低基因敲除小鼠的总路程和中央运动时间。图D，E，F显示恐惧记忆实验，Mβ-CD提高基因敲除小鼠的情景记忆，但对线索记忆无效。图G，H，I显示水迷宫实验，Mβ-CD提高基因敲除小鼠的空间记忆。

具体实施方式

以下内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

实施例1：胆固醇的检测

1、实验材料

实验动物为Fmr1基因敲除(KO)和野生型正常对照鼠(WT)(FVB.129P2-Fmr1tm1Cgr种系)。饲养于恒温、恒湿，12小时照明、自由饮水动物室内，颗粒饲料喂养。所有实验程序符合空军军医大学动物使用与管理委员会规定。

胆固醇定量试剂盒购置Sigma公司(货号：MAK043)，NeuN抗体购置Abcam公司(货号：ab177487)，Filipin III购置Cayman公司(货号：70440)，用DMSO配制成50mg/ml储存液，使用时用PBS稀释成50μg/ml。激光共聚焦显微镜(日本奥林巴斯FV1000)，微孔板多功能检测仪(Promaga公司)。

2、实验方法

(1)ELISA检测胆固醇：

a)收集动物血清和海马组织，置于-20℃保存，避免反复冻融；

b)配置匀浆液(氯仿：异丙醇：NP-40＝7：11：0.1)，每份样品中加入200μl匀浆液，注射器抽打均匀；

c)13000g，离心10min，收集上层有机相至新的Ep管中；

d)空气50℃干燥，去除沉淀；

e)放入真空箱30min，去除残留有机相；

f)加入200μl胆固醇检测缓冲液，振荡混匀；

g)制备标准品，浓度分别为5、4、3、2、1和0μg/孔；

h)每孔标准品和样品各50μl体积，再加入50μl探针和混合液，振荡后，37℃避光孵育60min；

i)分光光度计在570nm检测，或者荧光分光光度计在激发波长535nm和发射波长587nm时检测。

(2)胆固醇染色：海马脑片用PBS漂洗3次后，先用4％多聚甲醛固定30min，再用含0.1％Triton-X的山羊血清室温封闭30min，加入含兔源的NeuN一抗4℃孵育过夜。第二天用PBS漂洗干净后，加入羊抗兔的FITC标记绿色荧光二抗，同时加入PBS稀释后的2.5μg/ml的filipin III，室温避光孵育2h。漂洗3次，50％甘油封片，镜下观察。

3、实验结果

如图1所示，ELISA检测发现，血清中的总胆固醇含量在2周龄和5周龄的正常和基因敲除小鼠中均没有差别，但是5周龄的基因敲除小鼠中，游离胆固醇含量低于正常组，说明其结合的胆固醇量高于正常组。同样地，在海马组织中检测的胆固醇含量结果与血清中一致。2周龄的正常和基因敲除小鼠中总胆固醇和游离胆固醇没有差别，但是5周龄的基因敲除小鼠中结合的胆固醇量高于正常组。并且，细胞染色也显示胆固醇(蓝色)在神经元阳性的细胞(绿色)中浓度，5周龄的基因敲除小鼠中海马CA1脑区高于正常组。这些结果表明脆性X综合征小鼠中胆固醇代谢紊乱，导致海马的细胞中出现过度胆固醇积累。

实施例2：环糊精对神经元中AMPA受体的影响

1、实验材料

甲基-β-环糊精(Mβ-CD)购自Sigma公司(货号：C4555)，使用时先用DMSO配成0.5M的储存液，用前再用PBS稀释成5mM，对神经元给予时作用60min。胆固醇购自Sigma公司(货号：C3045)，使用时先用DMSO配成1mg/ml的储存液，用前再用PBS稀释成15μg/ml，对神经元给予时作用60min。DHPG购置Tocris公司(货号：No.0342)，使用浓度为100μM。一级抗体均购自Abcam公司：anti-Cav1(ab2910),anti-p(Y14)Cav1(ab131235),anti-GluA2(ab20673),anti-p(S880)GluA2(ab52180)。

神经元培养的试剂包括DMEM培养基、Neurobasal培养基和B27添加物等均购自Invitrogen公司，生物素化试剂购自Thermo scientific公司。

2、实验方法

(1)神经元的原代培养：原代培养的海马神经元通过取14-16d的胚胎，置于冰浴的D-Hank’s平衡液中，在解剖显微镜下分离海马部位，剪碎后转移至0.25％胰蛋白酶，37℃消化15min。用含20％FBS的DMEM终止消化两次，将细胞过滤、计数、重悬，接种于多聚赖氨酸(50μg/ml)包被的培养板中。24h后，培养液更换为含2％B27的Neurobasal培养液，此后每隔3d半量换液一次。培养10-14d的神经元即可用于实验。

(2)Western blot检测总蛋白水平：收集的细胞加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂和PMSF)于冰上用超声波细胞粉碎仪匀浆10次(25Hz，3s/次)，最终匀浆至清亮。4℃，12000rpm离心20min，收集上清液置于冰上。取少量上清用BCA法定量，剩余的加入1/4体积的5×loading buffer沸水煮8min，等待上样。样本用12％的SDS-PAGE凝胶电泳分离，80V，2h，之后100V转膜100min，再用5％脱脂奶粉封闭2-4h，加入一抗，4℃孵育过夜。

(3)生物素化提取膜蛋白：培养的海马神经元给予处理后，用冰浴PBS漂洗两次，每个大皿中加入10ml Sulfo-NHS-SS-Biotin，于4℃孵育30min；加入500μl Quenchingsolution终止反应后，刮下细胞以500g离心3min，弃上清；用5ml TBS轻柔漂洗沉淀，加500μl含蛋白酶抑制剂的裂解液；超声匀浆后冰浴30min，以10000g于4℃离心2min，保存上清；将收集的上清液与500μl NeutroAvidin Agarose混合，室温摇晃孵育1h；用1000g离心1min，弃滤液，再用洗涤液漂洗磁珠3次；最后加400μl含1M DTT的SDS-PAGE buffer到磁珠中，室温孵育1h，以1000g离心2min即得膜蛋白样品。样品经SDS-PAGE凝胶电泳，用免疫印迹杂交进行分析。

3、实验结果

如图2所示，DHPG通过激活I型代谢型谷氨酸，可以诱导AMPA受体的GluA2亚基由胞膜向胞浆转移。与正常神经元相比，基因敲除神经元在DHPG诱导后出现更多的GluA2内化。但是提前给予Mβ-CD后，DHPG不再诱导过多GluA2内化，而一旦同时给予胆固醇，又将使这一效应逆转。这表明环糊精纠正脆性X综合征神经元的AMPA受体异常转运是通过作用于胆固醇，进一步提示胆固醇及其参与形成的脂筏可被作为治疗脆性X综合征的有效靶点。

实施例3：环糊精对动物行为的影响

1、实验材料

实验动物为Fmr1基因敲除(KO)和野生型正常对照鼠(WT)(FVB.129P2-Fmr1tm1Cgr种系)。饲养于恒温、恒湿，12小时照明、自由饮水动物室内，颗粒饲料喂养。所有实验程序符合空军军医大学动物使用与管理委员会规定。

2、实验方法

(1)旷场试验(open field test)：将动物放入旷场反应箱内底面中心，小鼠旷场反应箱高25～30cm，底边长72cm，内壁涂黑，正上方2m处架一数码摄像头，其视野可覆盖整个旷场内部。摄像记录动物15min的行为变化。每次实验时及时清洗方箱内壁及底面，以免上次动物余留的气味影响下次测试结果。最后根据软件统计小鼠总的运动距离、沿边运动距离、中央运动距离和停留时间等指标。

(2)Morris水迷宫试验(Morris water maze test)：将水池分成东南西北四个区域，倒入不透明剂Lytron621，使液面高出其下隐藏的小平台1-2cm。训练时每次把小鼠随机的从其中一个区域面朝池壁放入水池中，让动物在水池内游泳直到找到隐藏在水面下的平台为止。每次训练时间为90s，找到平台后允许动物在平台上滞留30s，如果动物在规定时间内没有找到平台，则帮助其找到平台，每次训练间隔时间为30s，每天训练两次，实验一共进行7d。摄像记录动物的行为，软件分析动物找到平台每次所花的时间、游泳轨迹和游泳速度等。

(3)恐惧记忆试验(fear memory test)：将小鼠置于Med红外视频恐惧箱中，建立条件性恐惧记忆的实验模型。用90分贝的噪音(5kHz)作为条件性刺激，1.0mA的足部电击作为非条件性刺激。在训练的第一天，先让小鼠在实验装置内适应1min，然后给予30s的条件刺激，同时给予2s的非条件刺激，间隔1min后，重复条件刺激和非条件刺激进行关联，重复3次，用视频分析软件(Actimetrics Software)统计小鼠在各试验间期中的不动时间百分比。到第二天检测时，将小鼠置于原来的环境中，自由探索5min，不给予任何刺激。第三天时，改变恐惧箱环境，包括图形和气味，使小鼠在其中自由探索2min，之后给予声音刺激后记录3min，统计小鼠的不动时间百分比。

3、实验结果

如图3所示，甲基-β-环糊精(Mβ-CD)用生理盐水溶解后，分别制成0、125mg/kg(低剂量)、250mg/kg(中剂量)和500mg/kg(高剂量)浓度，对5周龄的正常或基因敲除小鼠连续皮下注射环糊精两周，每周两次。我们发现在旷场实验中，低、中、高剂量的Mβ-CD均能显著缩短基因敲除小鼠的总活动路程和中央活动时间。在恐惧记忆实验中，空间导致的情景记忆是由海马介导的，而杏仁核主要参与条件刺激产生的线索记忆。我们发现低和中剂量的Mβ-CD可以显著增加情景记忆中的小鼠不动时间，使基因敲除小鼠的记忆效应类似于正常小鼠，但是对线索记忆中的不动时间没有影响。最后在Morris水迷宫实验中，随着训练次数的增加，注射低和中剂量的基因敲除小鼠可以快速的找到隐藏于水面的平台，并且穿越平台的次数也明显增加，说明其空间记忆得到提高。这些行为学结果表明，长期给予Mβ-CD可以明显改善脆性X综合征小鼠的活动过度，以及海马依赖的情景记忆和空间记忆障碍。通过合理开发环糊精，制成适当剂型，可望在临床治疗脆性X综合征提供新的药物。

参考文献：

1.Gao,F.B.,Understanding fragile X syndrome:insights from retardedflies.Neuron,2002.34(6):p.859-62.

2.Feng,Y.,et al.,Fragile X mental retardation protein:nucleocytoplasmic shuttling and association with somatodendritic ribosomes.JNeurosci,1997.17(5):p.1539-47.

3.Bear,M.F.,K.M.Huber,and S.T.Warren,The mGluR theory of fragile Xmental retardation.Trends Neurosci,2004.27(7):p.370-7.

4.Cohen,A.W.,et al.,Role of caveolae and caveolins in health anddisease.Physiol Rev,2004.84(4):p.1341-79.