一种肠道给药载体巯基化海藻酸钙微球及其制备方法

摘要

本发明涉及一种肠道给药载体巯基化海藻酸钙微球及其制备方法。本方法将海藻酸钠和巯基化海藻酸钠按质量比（1~8）：1混合后配制质量浓度为0.5%~5%的溶液，之后加入含表面活性剂的油相，室温下于200~900rpm乳化45min，加入CaCl

说明书

技术领域

本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种粒径均一可控、单分散性好且具有良好肠道粘附性和pH响应性的用于肠道给药载体巯基化海藻酸钙微球及其制备方法。

背景技术

随着生物医药技术的迅速发展，蛋白质、多肽和酶等生物活性大分子药物等被用于癌症、心血管等疾病的诊断或治疗。大分子药物常常是通过静脉注射等方式进入人体，这会给病人带来生理上的疼痛和心理上的恐慌。而通过口服等非静脉注射方式会降低药物的生物利用度，这是因为蛋白或多肽类药物经口服后会被胃肠道中的胃蛋白酶和胰蛋白酶等降解而失去活性，因此达不到治疗的效果。此外胃肠道粘膜对药物的粘附性较低，药物经口服后，会快速被肝脏、脾脏降解，因此需要多次给药。

研究表明，具有粘附胃肠道粘膜和单向释放药物性质的给药载体能减少药物在胃肠道中与胃蛋白酶和胰蛋白酶等的接触时间，有效避免了药物的降解。可作为粘膜粘附材料的有卡波姆、壳聚糖、海藻酸钠和聚乙烯醇等天然或合成高分子。相比较而言，海藻酸钠在作为胃肠道给药载体中的应用具有优势。海藻酸钠是从海洋植物如海带、巨藻和马尾藻中提取的天然阴离子多糖，其分子是由β-D-甘露糖醛酸（M单元）和α-L-古罗糖醛酸（G单元）按1-4糖苷键连接。由于具有良好的生物可降解性、生物相容性和在温和条件下迅速成胶的能力，海藻酸钠是一种理想的药物载体。在Cu²⁺、Ca²⁺和Mg²⁺等二价离子存在时，G单元堆积形成交联网络，在胃部等强酸性环境下质子化，处于收缩状态，而在小肠等弱碱性环境下，亲水性增强，链条伸展，故其是一种良好的肠道定向给药载体。但在作为载药体时，海藻酸钠的突释现象过于明显，通过传统乳化法制备的海藻酸钙微球通常在20min内药物就已经释放了80%，导致药物浓度过高，甚至会危害到病人健康。此外，广泛存在于胃肠道细胞上的P-gp转运体是一种药物外排转运蛋白，它使得已经进入细胞的药物又外排出去，从而限制了许多外源药物的口服吸收，降低了药物的生物利用度。

海藻酸钠是通过范德华力、氢键和静电吸引等非共价键作用粘附于小肠粘膜层，因此与共价键相比其粘附性不强。通过在聚合物侧链引入巯基而构建的巯基化合物是一种新型的粘膜粘附聚合物。与其它聚合物不同的是，巯基化合物能通过巯基与小肠黏膜层糖蛋白上富含半胱氨酸区域中的二硫键交换形成新的二硫键，以将化合物牢牢固定在小肠粘膜上。此外，研究表明巯基化合物能有效抑制P-gp转运体的活性，降低P-gp的基因表达。因此，以含有巯基的化合物制备的药物载体能够显著延长药物在肠道中的停留时间，限制P-gp转运体的外排作用，进而增加药物渗透进入血液中的量。

基于此，本发明首先将巯基化海藻酸钠和海藻酸钠均匀混合，然后使用乳化法在Ca²⁺的交联作用下制备用于肠道靶向给药的巯基化海藻酸钙微球。该微球具有粒径均一可控、单分散性好且具有良好肠道粘附性和pH响应性等特点。本发明提供的海藻酸钙微球在作为蛋白质、多肽等生物活性药物载药体系以及肠道定向给药领域中具有潜在的市场应用前景。

发明内容

一种肠道给药载体巯基化海藻酸钙微球，其特征在于通过乳化法和Ca²⁺交联制备的粒径均一可控、单分散性好、具有良好肠道粘附性和pH响应性的巯基化海藻酸钙微球，具体制备方法如下：

（1）将海藻酸钠和巯基含量为100~800μmol/g的巯基化海藻酸钠按质量比为（1~8）：1均匀混合，然后配制成质量浓度为0.5%~5%的混合水溶液，作为分散相；将油相A和石油醚按体积比为10：（1~7）混合，然后加入占混合油相质量2~15%的表面活性剂，作为连续相；

（2）将1体积份分散相滴加到3~16体积份的连续相中，室温下于200~900rpm乳化45min，接着向上述乳液中加入占海藻酸钠和巯基化海藻酸钠的混合物干重

5%~15%的CaCl₂粉末，室温下于100~400rpm继续搅拌0.5~3h以交联固化微球，然后将乳液于1000~4000rpm下离心5~30min收集微球，之后分别用石油醚、异丙醇和去离子水洗涤以去除微球中残余的油相、表面活性剂和交联剂，最后将微球经100~1800目细胞筛筛分，即得到肠道给药载体巯基化海藻酸钙微球；

所述油相A为大豆油、液体石蜡、葵花籽油、花生油、苯甲酸苄酯、苯甲酸乙酯、聚甘油蓖麻醇三酯、单硬脂酸甘油酯中的一种或几种混合物；

所述表面活性剂为山梨醇甘油酸酯、失水山梨醇三油酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇六硬脂酸酯、乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物、丙二醇脂肪酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、丙二醇脂肪酸酯、乙二醇脂肪酸酯、失水山梨醇倍半油酸酯、羟基化羊毛酯中的一种或几种混合物。

以上制备方法中，所述巯基化海藻酸钠为L-半胱氨酸-海藻酸钠缀合物、巯基乙酸-海藻酸钠缀合物、N-乙酰半胱氨酸-海藻酸钠缀合物和巯基丙酸-海藻酸钠缀合物中的一种或几种混合物；

所述L-半胱氨酸-海藻酸钠缀合物和N-乙酰半胱氨酸-海藻酸钠缀合物的制备方法如下：配制质量浓度为1%~4%的海藻酸钠水溶液，加入5mL浓度为30~50mM碳二亚胺水溶液并搅拌45min，然后加入0.5~4g L-半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸并混合均匀，用1M盐酸溶液将上述混合溶液pH调节到5，室温下避光搅拌反应3h，于8000~14000kDa透析袋中以1mM盐酸溶液作为透析外液透析两次，再以含1%氯化钠的1mM盐酸溶液作为透析外液透析两次，最后以1mM盐酸溶液作为透析外液透析两次，每次透析时间为12~24h，将透析后所得反应液经冷冻干燥制备得到L-半胱氨酸-海藻酸钠缀合物或N-乙酰半胱氨酸-海藻酸钠缀合物；

所述巯基乙酸-海藻酸钠缀合物和巯基丙酸-海藻酸钠缀合物的制备方法如下：将5~10g海藻酸钠溶于10~50mL水中，然后分别加入3~6g巯基乙酸或巯基丙酸，之后加入2mL浓度为7M的盐酸溶液，于80℃下避光搅拌反应2.5h，之后将所得反应混合物倒入250mL乙醇中，过滤后将沉淀用乙醇洗涤两次，于室温下干燥即制备得到巯基乙酸-海藻酸钠缀合物或巯基丙酸-海藻酸钠缀合物。

本发明与传统乳化法制备的海藻酸钙微球相比，具有如下优点：

（1） 微球中引入了巯基，极大的增强了其作为载药体在肠道中的粘膜粘附性，提高了微球在肠道中的停留时间，增加了药物在体内的循环时间；

（2） 乳化时直接采用CaCl₂粉末交联固化微球，没有破坏初乳液的稳定性，微球成球好，表面较为致密，装载药物后在强酸性条件下几乎没有释放，在弱碱性条件下具有较强的缓释能力；

（3） 乳化时采用的是混合油相作为连续相，通过调节其中石油醚和其它油相的比例，可以很好的调节油相的粘度，从而控制微球的粒径，制备出具有高度单分散性的微球。微球在经过细胞筛分级后，粒径分布很窄。

具体实施方式

下面给出本发明的4个实施例，通过实施例对本发明进行具体描述。有必要指出的是，实施例只用于对本发明做进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可根据本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。

实施例1

配制质量浓度为1%的海藻酸钠水溶液，加入5mL浓度为30mM碳二亚胺水溶液并搅拌45min，然后加入1g L-半胱氨酸并混合均匀，用1M盐酸溶液将上述混合溶液pH调节到5，室温下避光搅拌反应3h，于8000~14000kDa透析袋中以1mM盐酸溶液作为透析外液透析两次，再以含1%氯化钠的1mM盐酸溶液作为透析外液透析两次，最后以1mM盐酸溶液作为透析外液透析两次，每次透析时间为12~24h，将透析后所得反应液经冷冻干燥制备得到L-半胱氨酸-海藻酸钠缀合物；将海藻酸钠和巯基含量为400μmol/g的L-半胱氨酸-海藻酸钠缀合物按质量比为3：1均匀混合，然后配制成质量浓度为0.8%的混合水溶液，作为分散相；将葵花籽油和石油醚按体积比为10：1混合，然后加入占混合油相质量3%的山梨醇甘油酸酯，作为连续相；将1体积份分散相滴加到6体积份的连续相中，室温下于500rpm乳化45min，接着向上述乳液中加入占海藻酸钠和L-半胱氨酸-海藻酸钠缀合物的混合物干重5%的CaCl₂粉末，室温下于300rpm继续搅拌1h以交联固化微球，然后将乳液于1000rpm下离心30min收集微球，之后分别用石油醚、异丙醇和去离子水洗涤以去除微球中残余的油相、表面活性剂和交联剂，最后将微球经400目细胞筛筛分，即得到巯基化海藻酸钙微球。

实施例2

将7g海藻酸钠溶于50mL水中，然后分别加入3g巯基乙酸以及2mL浓度为7M的盐酸溶液，于80℃下避光搅拌反应2.5h，之后将所得反应混合物倒入250mL乙醇中，过滤后将沉淀用乙醇洗涤两次，于室温下干燥制备得到巯基乙酸-海藻酸钠缀合物。将海藻酸钠和巯基含量为300μmol/g的巯基乙酸-海藻酸钠缀合物按质量比为2：1均匀混合，然后配制成质量浓度为1%的混合水溶液，作为分散相；将花生油和石油醚按体积比为10：6混合，然后加入占混合油相质量3%的丙二醇单硬脂酸酯，作为连续相；将1体积份分散相滴加到13体积份的连续相中，室温下于300rpm乳化45min，接着向上述乳液中加入占海藻酸钠和巯基乙酸-海藻酸钠缀合物的混合物干重8%的CaCl₂粉末，室温下于300rpm继续搅拌1h以交联固化微球，然后将乳液于1500rpm下离心26min收集微球，之后分别用石油醚、异丙醇和去离子水洗涤以去除微球中残余的油相、表面活性剂和交联剂，最后将微球经600目细胞筛筛分，即得到巯基化海藻酸钙微球。

实施例3

配制质量浓度为3%的海藻酸钠水溶液，加入5mL浓度为45mM碳二亚胺水溶液并搅拌45min，然后加入3g N-乙酰半胱氨酸并混合均匀，用1M盐酸溶液将上述混合溶液pH调节到5，室温下避光搅拌反应3h，于8000~14000kDa透析袋中以1mM盐酸溶液作为透析外液透析两次，再以含1%氯化钠的1mM盐酸溶液作为透析外液透析两次，最后以1mM盐酸溶液作为透析外液透析两次，每次透析时间为12~24h，将透析后所得反应液经冷冻干燥制备得到N-乙酰半胱氨酸-海藻酸钠缀合物；将海藻酸钠和巯基含量为267μmol/g的N-乙酰半胱氨酸-海藻酸钠缀合按质量比为4：1均匀混合，然后配制成质量浓度为1%的混合水溶液，作为分散相；将大豆油和石油醚按体积比为10：4混合，然后加入占混合油相质量3%的丙二醇脂肪酸酯，作为连续相；将1体积份分散相滴加到10体积份的连续相中，室温下于200rpm乳化45min，接着向上述乳液中加入占海藻酸钠和N-乙酰半胱氨酸-海藻酸钠的混合物干重5%的CaCl₂粉末，室温下于100rpm继续搅拌2h以交联固化微球，然后将乳液于3000rpm下离心20min收集微球，之后分别用石油醚、异丙醇和去离子水洗涤以去除微球中残余的油相、表面活性剂和交联剂，最后将微球经300目细胞筛筛分，即得到巯基化海藻酸钙微球。

实施例4

将6g海藻酸钠溶于10mL水中，然后分别加入4g巯基丙酸以及2mL浓度为7M的盐酸溶液，于80℃下避光搅拌反应2.5h，之后将所得反应混合物倒入250mL乙醇中，过滤后将沉淀用乙醇洗涤两次，于室温下干燥制备得到巯基丙酸-海藻酸钠缀合物；将海藻酸钠和巯基含量为800μmol/g的巯基丙酸-海藻酸钠缀合物-海藻酸钠缀合按质量比为8：1均匀混合，然后配制成质量浓度为1.5%的混合水溶液，作为分散相；将苯甲酸苄酯和石油醚按体积比为10：5混合，然后加入占混合油相质量10%的丙二醇脂肪酸酯，作为连续相；将1体积份分散相滴加到5体积份的连续相中，室温下于400rpm乳化45min，接着向上述乳液中加入占海藻酸钠和巯基乙胺-海藻酸钠缀合物的混合物干重5%的CaCl₂粉末，室温下于250rpm继续搅拌3h以交联固化微球，然后将乳液于1800rpm下离心10min收集微球，之后分别用石油醚、异丙醇和去离子水洗涤以去除微球中残余的油相、表面活性剂和交联剂，最后将微球经800目细胞筛筛分，即得到巯基化海藻酸钙微球。