利用InDel标记鉴定柑橘柚杂交子代的试剂盒及方法

摘要

本发明涉及利用InDel标记鉴定柑橘柚类植物杂交子代的试剂盒，包括17个引物对中的一个或多个引物对；还涉及利用InDel标记鉴定柑橘柚类植物杂交子代的方法，包括以下步骤：获得待鉴定的柑橘柚类植物子代的基因组，以及预期的父本和母本的基因组，使用引物对分别扩增待鉴定的柑橘柚类植物子代的基因组以及预期的父本和母本的基因组中相应的InDel标记，将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，根据电泳带型判定待鉴定的柑橘柚类植物交子代是否是预期父本和母本杂交而得的杂交子代。本发明的试剂盒和方法可以简便快捷地运用于相关柚品种的科研或杂交育种实践中，同时为其他柚类品种的育种工作提供有效的方法和思路并且奠定了良好的基础。

说明书

技术领域

本发明涉及柑橘种植和育种领域，更特别地，涉及一种利用InDel标记鉴定柑橘柚类植物杂交子代的试剂盒及鉴定方法。

背景技术

柑橘是世界上第一大类水果，产业经济价值巨大，柑橘柚类(Citrus grandis)是其中很重要的一部分。我国柚类的种植面积和产量均居世界首位，以沙田柚、琯溪蜜柚、坪山蜜柚、垫江白柚等我国传统优良柚品种为主，种植面积较大。随着柚类产业的迅速发展，在科研和产业方面存在一些问题亟待解决。我国的柚类品种、技术配套仍处于发展的初级阶段，品种多杂乱，生产结构与熟期结构不合理。

杂交育种是种质创新的主要手段，利用已有的优良柚类品种创制更符合现代产业体系的新品种极为重要，杂交群体子代的鉴定工作是杂交育种的基础。现有的柚类杂种鉴定技术主要包括形态型鉴定和分子标记鉴定。

形态学标记主要为树体特性，如叶型、果实外观、树势等以及结合一些生理特性。可利用的形态标记较少，易受环境影响，并且柚类杂种幼苗的形态学特征十分相似，因此在早期无法进行准确鉴定。

随着现代分子标记技术的建立与成熟，为作物的杂种真实性的早期鉴定提供了更加准确而高效的方法。现有的分子标记技术包括RAPD、AFLP、SSR。随机扩增多态性DNA(RAPD)是建立在PCR基础上对基因组进行多态性分析的分子技术，其扩增的稳定性和重复性缺陷严重；扩增片段长度多态性标记技术(AFLP)常用于鉴定种系DNA指纹、果树品种遗传多样性等，但易存在假阳性片段，降低鉴定准确性；简单重复序列(SSR)是目前运用相对较多的分子标记技术，其标记分布在整个基因组中、多态性高，但其标记带型需通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行区分，操作过程繁琐，并且会涉及一些毒性大的试剂，因此不适合安全高效的进行鉴定工作。

上述技术方法都在一些方面的缺陷而限制了在于杂种鉴定工作中的运用，因此，现阶段需要一种能准确、经济、高效的杂种鉴定方法以期提高科研或育种过程效率。

发明内容

为解决以上问题，我们开发了一种利用InDel标记鉴定柑橘柚类植物杂交子代的试剂盒，包括17个引物对中的一个或多个引物对，所述17个引物对的序列如SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO:3和4、SEQ ID NO:5和6、SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:13和14、SEQ ID NO:15和16、SEQ ID NO:17和18、SEQ ID NO:19和20、SEQ IDNO:21和22、SEQ ID NO:23和24、SEQ ID NO:25和26、SEQ ID NO:27和28、SEQ ID NO:29和30、SEQ ID NO:31和32、SEQ ID NO:33和34所示。

在一个实施方案中，所述试剂盒还包括用PCR的其他试剂。

本发明还提供了一种利用InDel标记鉴定柑橘柚类植物杂交子代的方法，包括以下步骤：

S1：获得待鉴定的柑橘柚类植物子代的基因组DNA，以及预期的父本和母本的基因组DNA；

S2：使用17个引物对中的一个或多个引物对分别扩增待鉴定的柑橘柚类植物子代的基因组DNA以及预期的父本和母本的基因组DNA中相应的InDel标记，所述17个引物对的序列如SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO:3和4、SEQ ID NO:5和6、SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:13和14、SEQ ID NO:15和16、SEQ ID NO:17和18、SEQID NO:19和20、SEQ ID NO:21和22、SEQ ID NO:23和24、SEQ ID NO:25和26、SEQ ID NO:27和28、SEQ ID NO:29和30、SEQ ID NO:31和32、SEQ ID NO:33和34所示；

S3：将S2中的PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，根据电泳带型判定待鉴定的柑橘柚类植物交子代是否是所述预期父本和母本杂交而得的杂交子代。

在一个实施方案中，所述预期的父本和母本为高班柚、晚白柚、HB柚、水晶蜜柚、缅甸柚、琯溪蜜柚、云南无酸柚、桂林沙田柚、桂林酸柚中的任意两种组合。

在一个实施方案中，S2中PCR循环的退火温度为55℃，延伸时间为1min。

本发明首次提供了基于9个柚品种重测序数据设计的高质量、高特异性InDel标记引物对，最终筛选出17有效引物可以对9个柚品种及其杂种子代进行有效鉴定。本发明的试剂盒和方法可以简便快捷地运用于相关柚品种的科研或杂交育种实践中，同时为其他柚类品种的育种工作提供有效的方法和思路并且奠定了良好的基础。

附图说明

图1为9个柚类品种杂交组合父母本特征条带及其对应的InDel标记引物名称；

图2为InDel-11检测HB柚、高班柚杂交组合及其子代鉴定胶图；

图3为InDel-9检测HB柚、琯溪蜜柚杂交组合及其子代鉴定胶图；

图4为InDel-3检测HB柚、沙田柚杂交组合及其子代鉴定胶图；

图5为InDel-14检测水晶柚、沙田柚杂交组合及其子代鉴定胶图；

图6为InDel-4检测晚白柚、水晶柚杂交组合及其子代鉴定胶图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.InDel引物设计以及筛选

1.1材料选取

选取9个柚类品种为杂交亲本，如表1所示，而后将9个柚品种两两组合进行杂交得到子代。用CTAB微量法分别提取母本及各自杂交组合子代的基因组DNA并进行纯化，达到重测序所需的质量要求。

表1 9个柚类品种的信息

1.2InDel标记引物对设计以及有效引物对的筛选

根据上述9个柚品种的基因组重测序数据设计特异的高质量引物对，然后对InDel标记引物对进行有效性筛选。所有的引物对分别对9个柚亲本进行PCR扩增，电泳检测扩增条带，挑选出可在杂交组合父母本中扩增出特征条带的引物对作为候选的有效杂种鉴定引物。

具体操作步骤如下：

10μl PCR扩增体系为：5μl 2x Taq plus master mix，0.25μl正引物，0.25μl反引物，150ng DNA模板，并用水补足至10μl。扩增条件为先94℃预变性5min；再94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃延伸5min。

按照以上PCR扩增后，取7μl的PCR产物于1.5-2％琼脂糖凝胶电泳检测。根据检测结果最终确定了17对有效引物对可以区分不同杂交组合的亲本，可得到差异条带，引物信息如表2所示。以及不同杂交组合父母本特征条带与所对应的引物对名称，如图1所示。表3示出了InDel标记引物对可用于鉴定的杂交组合。

表2 17对引物信息汇总

表3 InDel标记引物对及可鉴定的杂交组合

2.对杂种子代的鉴定

选取了5个杂交组合及其子代群体作为验证展示：HB柚(HB)×高班柚(GB)、HB柚(HB)×琯溪蜜柚(GX)、HB柚(HB)×沙田柚(ST)、水晶柚(SJ)×沙田柚(ST)、晚白柚(WB)×水晶柚(SJ)。

根据上文方法分别提取子代的基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测合格，分光光度计检测浓度，稀释浓度至150ng/μl，用作PCR扩增模板。

10μl PCR扩增体系为：5μl 2x Taq plus master mix，0.25μl正引物，0.25μl正引物，150ng DNA模板，并用水补足至10μl。扩增条件为先94℃预变性5min；再94℃变性30s，55℃退火30s(退火温度参照表2)，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃延伸5min。检测各子代所用的引物以及检测的子代植株的数量如表4所示。

表4 各子代所用的引物以及检测的子代植株的数量

杂交检测引物检测的子代数量(株)HB柚(HB)×高班柚(GB)InDel-1194HB柚(HB)×琯溪蜜柚(GX)InDel-984HB柚(HB)×沙田柚(ST)InDel-394水晶柚(SJ)×沙田柚(ST)InDel-1483晚白柚(WB)×水晶柚(SJ)InDel-461

按照以上PCR扩增后，取7μl的PCR产物于1.5-2％琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图2-6所示，胶图第一个泳道为父本特征条带，第二个泳道为母本特征条带，后面的泳道是子代的条带，如果子代同时出现父本与母本的特征条带即认为是该父本和母本杂交得到的真正杂种。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 利用InDel标记鉴定柑橘柚杂交子代的试剂盒及方法

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