一种铅笔绘制双极电极纸芯片甲胎蛋白免疫传感器的制备方法

摘要

本发明公开了一种铅笔绘制双极电极纸芯片甲胎蛋白免疫传感器的制备方法，属于生物传感器领域。本发明在纸基基底上利用铅笔绘制驱动电极和双极电极，双极电极的阴极首先修饰石墨烯，然后通过戊二醛固定甲胎蛋白一抗，钯金/多壁碳纳米管复合物标记二抗，利用夹心免疫方式识别捕获甲胎蛋白，制得低成本、操作简单及背景干扰小的铅笔绘制双极电极纸芯片甲胎蛋白免疫传感器。

说明书

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，更具体地说是一种铅笔绘制双极电极纸芯片甲胎蛋白免疫传感器的制备方法。

背景技术

甲胎蛋白是原发性肝癌确诊最重要的生物标志物，血清中甲胎蛋白含量的检测对肝癌临床诊断以及早期筛查具有重要意义。原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均局全球首位，我国每年新发的病例占全球每年新发的原发性肝癌病例的一半以上，且发病率呈逐年上升趋势。在我国仅次于肺癌，排行恶性肿瘤死亡率的第2位。目前，血清中甲胎蛋白含量的确定，临床检测主要采用免疫测定法，常规免疫测定包括酶联免疫吸附测定、放射免疫测定以及荧光免疫测定。但是，这些方法固有其自身缺陷，如会存在部分标记抗体的损失，会造成辐射危害以及环境污染等；并且，荧光免疫测定中所需的标记物价格昂贵且容易受到外界干扰。此外，以上分析方法所需分析时间长，且需具备熟练的操作人员。

近年来为了满足人们对简单，便携，高效，临床诊断的需求，纸芯片开始被用作生物分析实验平台。自从2007年Whitesides课题组首次提出了微流控纸芯片的概念以来，纸芯片器件发展迅猛。微流控纸芯片以纸为基底，代替传统的导电玻璃等材料，逐渐成为一种新颖的分析器件。纸芯片价格低廉，加工简单且成本低；纸纤维表面生物相容性比较好，便于生物物质的链接如蛋白质、细胞及适配体等生物分子；其后处理方法简便、无污染，如燃烧法；另外，纸张质量轻、易运输和储存、易于折叠等优点。通过铅笔在纸上手绘制备双极电极纸芯片，双极电极可以有效地将检测目标物和信号分子隔离开，在无干扰的条件下通过信号端光信号的测定实现对检测端的间接检测。构建一种选择性好、结构简单、操作方便、成本低廉的双极电极纸芯片甲胎蛋白免疫传感器，具有重要意义和广阔的市场价值。

发明内容

本发明的目的是通过一种铅笔绘制双极电极纸芯片构建甲胎蛋白免疫传感器用于高选择、高灵敏、简便、低成本地检测甲胎蛋白。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：

(1)在计算机上利用Adobe illustrator软件设计双极电极纸芯片的亲疏水蜡打印图案，如附图1所示；

(2)将步骤(1)中设计的打印图案通过蜡打印机打印在色谱纸上，随后将打印过的A4色谱纸放置到平板加热器或烘箱中，在100℃下加热100s，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；

(3)将步骤(2)中获得的纸芯片通过铅笔绘制驱动电极；

(4)将步骤(3)中获得的纸芯片双极电极区域利用6B铅笔绘制，双极电极绘制后碾磨平整；

(5)将步骤(4)中获得的纸芯片双极电极阴极区域滴加20μL 0.2～1.0mg/mL石墨烯及2.0mg/mL壳聚糖混合液，依次滴加10μL 1％戊二醛，10～20μL 10μg/mL的甲胎蛋白捕获抗体溶液，孵育20～30分钟，然后滴加10μL 2％牛血清白蛋白封闭活性位点，孵育 30分钟，用超纯水清洗三次；

(6)将步骤(5)中处理过的纸芯片双极电极阴极区域滴加10μL 50pg/mL～500ng/mL的一定量甲胎蛋白标准溶液，孵育20～30分钟，用超纯水清洗三次；

(7)将甲胎蛋白二抗固载于钯金与多壁碳纳米管复合材料(Ab2/PdAu/MWCNTs)，10μL10～30mg/mL二抗复合物溶液滴加至步骤(7)中处理过的双极电极阴极区域，室温孵育 20～30分钟，用超纯水清洗三次，制得甲胎蛋白双极电极纸芯片电致化学发光传感器；

(8)将步骤(7)中得到的纸芯片双极电极阳极区域信号池内加入50μL 0.1mol/L的磷酸缓冲溶液含有2.0～5.0mmol/L三联吡啶钌Ru(bpy)₃²⁺和30～50mmol/L三丙胺TPA，纸芯片双极电极阴极区域反应池内滴加50μL>2O₂溶液，在驱动阴极和驱动阳极间施加4.0～6.0V电压，测定信号池电致发光强度。

本发明所述步骤(1)中设计的纸芯片的尺寸如附图1所示，其中有驱动电极、反应池、双极电极、信号池，纸芯片双极电极4×14mm，双极电极两侧信号池和反应池为10×10mm的正方形。

本发明所述步骤(3)中铅笔可用4B，6B或者8B铅笔。

本发明所述步骤(8)中Ab2/PdAu/MWCNTs二抗复合物的制备步骤为：1.0mL 1.0mmol/L的氯化钯乙二醇溶液为钯前驱体溶液；1.0mL 1.0mmol/L的氯金酸乙二醇溶液作为金的前驱体溶液；使用3mol/L硝酸对多壁碳纳米管处理2小时，离心用超纯水洗至中性，80mg多壁碳纳米管加入到100mL体积比为4:1的乙二醇和异丙醇混合溶液中；上述溶液混合，搅拌1小时，加入氢氧化钾-乙二醇调节混合溶液pH大约10，利用微波辐射照射30 秒两次，间隔30秒，产物冷却至室温，硝酸调节pH大约4，溶于水中持续搅拌6小时滤去残余物，放入干燥箱中在60℃干燥12h，得到PdAu/MWCNTs复合物。将PdAu/MWCNTs 复合物与甲胎蛋白二抗Ab2混合，室温孵育30分钟，得到Ab2/PdAu/MWCNTs复合物。

本发明的有益效果

(1)利用纸芯片构建双极电极传感器实现信号和反应分开，避免背景干扰，提高方法的选择性。

(2)双极电极和外加电源之间无需导线相连，并且驱动电极及双极电极采用铅笔绘制，使得该检测器件价格低廉、操作简单，便于普及推广应用。

(3)双极电极信号端及反应端采用纳米材料修饰，提高检测方法的灵敏度。

附图说明

图1双极电极纸芯片图案A：信号池；B：双极电极阳极；C：双极电极阴极；D：反应池

实施例：铅笔绘制双极电极纸芯片传感器用于甲胎蛋白检测

(1)在计算机上利用Adobe illustrator软件设计双极电极纸芯片的亲疏水蜡打印图案，图案中有蜡疏水区、驱动电极区、双极电极区、信号区和反应区，尺寸、位置及形状如附图1所示；

(2)将步骤(1)中设计的打印图案通过蜡打印机打印在色谱纸上，随后将打印过的A4色谱纸放置到平板加热器或烘箱中，在100℃下加热100s，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；

(3)将步骤(2)中获得的纸芯片通过6B铅笔绘制驱动电极；

(4)将步骤(3)中获得的纸芯片双极电极区域利用6B铅笔绘制，双极电极绘制后碾磨平整，在纸芯片中制得双极电极；

(5)将步骤(4)中获得的纸芯片双极电极阴极区域滴加20μL 0.5mg/mL石墨烯和2.0mg/mL壳聚糖混合液，依次滴加10μL 1％戊二醛，20μL 10μg/mL的甲胎蛋白捕获抗体溶液，孵育30分钟，然后滴加10μL 2％牛血清白蛋白封闭活性位点，孵育30分钟，用超纯水清洗三次；

(6)将步骤(5)中处理过的纸芯片双极电极阴极区域滴加10μL 50pg/mL～500ng/mL的一定量甲胎蛋白标准溶液，孵育30分钟，用超纯水清洗三次；

(7)将甲胎蛋白二抗固载于钯金与多壁碳纳米管复合材料(Ab2/PdAu/MWCNTs)，1.0mL1.0mmol/L的氯化钯乙二醇溶液为钯前驱体溶液；1.0mL 1.0mmol/L的氯金酸乙二醇溶液作为金的前驱体溶液；使用3mol/L硝酸对多壁碳纳米管处理2小时，离心用超纯水洗至中性，80mg多壁碳纳米管加入到100mL体积比为4:1的乙二醇和异丙醇混合溶液中；上述溶液混合，搅拌1小时，加入氢氧化钾-乙二醇调节混合溶液pH大约10，利用微波辐射照射30秒两次，间隔30秒，产物冷却至室温，硝酸调节pH大约4，溶于水中持续搅拌6小时滤去残余物，放入干燥箱中在60℃干燥12h，得到PdAu/MWCNTs复合物。将 PdAu/MWCNTs复合物与甲胎蛋白二抗Ab2混合，室温孵育30分钟，得到 Ab2/PdAu/MWCNTs复合物；

(8)10μL 20mg/mL二抗复合物溶液滴加至步骤(7)中处理过的双极电极阴极区域，室温孵育30分钟，用超纯水清洗三次，制得甲胎蛋白双极电极纸芯片电致化学发光传感器；

(9)将步骤(8)中得到的纸芯片双极电极阳极区域信号池内加入50μL 0.1mol/L的磷酸缓冲溶液含有5.0mmol/L三联吡啶钌Ru(bpy)₃²⁺和50mmol/L三丙胺TPA，纸芯片双极电极阴极区域反应池内滴加50μL>2O₂溶液，在驱动电极间施加5.5V电压，对其电致发光强度进行检测。