一种原酸酯5-氟尿嘧啶前药分子、其制备方法及其酸敏感纳米粒和应用

摘要

本发明公开了一种原酸酯5‑氟尿嘧啶前药分子，其为具有式(I)所示结构的N‑5‑氟尿嘧啶1‑乙基‑2‑碳烷氧基‑(1,3)二氧戊环‑4‑甲基酰胺：

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体涉及一种原酸酯5-氟尿嘧啶前药分子、其制备方法及其酸敏感纳米粒和应用。

背景技术

目前在全世界范围内，癌症都已经成为严重威胁人类健康的罪魁祸首之一。据世界卫生组织统计，每年平均大约有820万人死于癌症。因此，有效地治疗癌症已经成为医疗领域迫不及待需要解决的问题。在众多治疗癌症的方法中，化学药物治疗(化疗)法是目前治疗癌症最有效的手段之一。然而，大部分用于化疗的抗肿瘤药都属于细胞毒性药物，且大部分药物存在溶解度低、稳定性差、治疗窗窄和药动学性质不佳等缺点，导致传统化疗制剂的治疗效果不佳且毒副作用严重，为了应对化疗药物在药物传递过程中存在的这些问题，多种药物传递策略被用来改善化疗药物的成药性并提高其抗肿瘤效果，包括设计前药和纳米物传递系统。前体药物，简称前药，通常指药物经过结构修饰后得到的在体外无活性或活性较小，在体内转化释放出活性药物而发挥药效的化合物。前药策略己经被广泛用来提高抗癌药物的传递效率。例如，5-氟尿嘧啶对绒毛上皮癌及恶性葡萄胎有显著疗效，对结肠癌、直肠癌、胃癌和乳腺癌、头颈部癌等有效，是治疗实体肿瘤的首选药物；然而其首过效应明显，毒性较大，临床应用时，可引起严重的胃肠道反应及骨髓抑制等副作用。为了提高疗效，增强选择性，减少毒副作用，近年来国内外学者对5-氟尿嘧啶进行了大量的化学修饰工作，并对其药理、毒性、代谢、抗癌活性等进行了研究。1975的日本学者最早合成了氟尿嘧啶衍生物氟尿嘧啶乙酸。氟尿嘧啶乙酸作为氟尿嘧啶的衍生物，不但保留了原来的抗肿瘤作用，而且减少了药物的毒副作用。更关键的是5-氟尿嘧啶乙酸中含有一个可以与载体相连接的羧基，为合成前体药物提供很多的可能性。

此外，随着纳米技术和生物材料在药物传递领域的深入研究和广泛应用，纳米药物载体在抗癌药物传递领域展现出独特的优势，包括：改善药物的成药性、延长药物在血液中的循环时间、通过EPR效应实现药物在肿瘤部位的被动靶向。尽管传统的前药策略和纳米药物传递技术己经取得了很大的进展，但仍然存在一些缺陷限制着它们的实际临床应用。小分子前药容易在体内被快速清除和过早地释放母药。而传统的纳米制剂也存在一些不足，主要包括载药效率低、稳定性差、载体材料相关的毒副作用和储存过程中药物的结晶和泄漏等问题。因此，基于前药策略、纳米技术和生物材料的快速发展，设计和构建更高效的新型药物传递系统仍然是抗癌药物递送领域的一个研究的热点和亟待解决的难题。

近年来，用于递送5-氟尿嘧啶的纳米级配方是一种很有前景的方法，增加溶解度，允许药物在肿瘤部位积聚具有增强的渗透性和保留(EPR)效应。在诸多纳米药物缓控释载体中，具有环境响应性的纳米药物载体被广泛研究，其中pH响应性纳米药物载体成为了研究者的热点。原酸酯键相比于其他酸敏感的化学键如缩醛、缩酮、乙烯基醚等具有更高的酸敏感性，可通过调节聚原酸酯的分子量以及疏水性来调控原酸酯的降解速度，从而调节药物的释放速率，因此有望通过合理的设计得到一种pH超响应性的缓控释药物载体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供了一种可有效治疗实体肿瘤的pH敏感的原酸酯5-氟尿嘧啶前药分子、其制备方法及其酸敏感纳米粒和应用。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

一方面，提供一种原酸酯5-氟尿嘧啶前药分子，其为具有式(I)所示结构的N-5-氟尿嘧啶1-乙基-2-碳烷氧基-(1,3)二氧戊环-4-甲基酰胺：

其中，n＝2～32，m＝n+2。

另一方面，还提供上述原酸酯5-氟尿嘧啶前药分子的制备方法，包括以下步骤：

A)真空条件下，疏水性一元醇、2,2,2-三氟-N-(2-甲氧基-[1,3]二戊烷-4-亚甲基)乙酰胺和吡啶对甲苯磺酸盐进行酯交换反应，三乙胺终止反应后获得2-碳烷氧基-(1,3)二氧戊环-4-甲基胺；其中按摩尔比计，疏水性一元醇：2,2,2-三氟-N-(2-甲氧基-[1,3]二戊烷-4-亚甲基)乙酰胺：吡啶对甲苯磺酸盐＝50～52:60～100:1；

B)氮气保护下，5-氟尿嘧啶-1-乙酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基丁二酰亚胺NHS进行活化羧基反应，之后加入2-碳烷氧基-(1,3)二氧戊环-4-甲基胺进行酰胺反应，再加入三乙胺，经旋蒸、透析、冷冻干燥，获得原酸酯5-氟尿嘧啶前药分子；其中按摩尔比计，5-氟尿嘧啶-1-乙酸：EDC：NHS：2-碳烷氧基-(1,3)二氧戊环-4-甲基胺＝1:1.5～4:1.5～4:0.6～1，更有选为1:3.2:3.2:0.65。

优选地，在步骤A)中，所述疏水性一元醇选自碳链长度为C₄-C₃₄的饱和一元醇和/或不饱和一元醇。

优选地，在步骤A)中，所述酯交换反应的温度为130℃，时间为6～8h。

优选地，在步骤A)中，三乙胺终止反应后，还包括：用二氯甲烷溶解反应体系，三乙胺的乙醇溶液进行沉降，-20℃下冷藏1h，过滤、抽真空；然后用三乙胺的四氢呋喃溶解抽真空后的反应体系，冷却的NaOH溶液洗涤、旋蒸、用二氯甲烷萃取、干燥过夜、抽滤旋蒸抽油泵，得到2-碳烷氧基-(1,3)二氧戊环-4-甲基胺的步骤。

优选地，在步骤B)中，所述活化羧基反应的温度为0℃左右，时间为3～6h；所述酰胺反应的温度为20～30℃，时间为48h。

优选地，在步骤B)中，所述透析为用截留分子量为500的透析袋透析2～3天。

优选地，所述透析袋中的透析液为浓度0.1％～2％的三乙胺水溶液或pH8.0的0.01M磷酸缓冲溶液。

又一方面，还提供一种酸敏感5-氟尿嘧啶前药纳米粒，其由上述原酸酯5-氟尿嘧啶前药分子或上述制备方法制备的原酸酯5-氟尿嘧啶前药分子制得。

再一方面，还提供上述酸敏感5-氟尿嘧啶前药纳米粒作为药物载体在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。

优选地，所述药物载体负载抗肿瘤试剂，所述抗肿瘤试剂选自喜树碱、顺铂、紫杉醇、阿霉素、环孢霉素和卡莫司汀中的一种或多种。

本发明相比现有技术具有以下优点：

1、所制备的原酸酯5-氟尿嘧啶前药分子，结构比较简单、明确，并且将脂溶性的不同长度的碳链醇与5-氟尿嘧啶-1-乙酸以化学键的形式相连，即5-氟尿嘧啶乙酸与安全无毒、无刺激性硬脂醇键合，改善药物的亲脂性，提高药物的脂溶性，使其更容易被细胞摄取，因此能更有效地穿过细胞膜，降低药物的毒副作用，因此，具有良好的酸降解性能、降低的肿瘤细胞毒性、一定的肿瘤靶向功能；

2、在原酸酯5-氟尿嘧啶前药分子中引入具有pH敏感性的原酸酯键，使得对肿瘤内的环境更加敏感，药物释放更加快，治疗效果更佳；

3、由原酸酯5-氟尿嘧啶前药分子制备的纳米粒不仅具有小分子前药的优点而且又赋予纳米药物传递系统(即药物载体)的优点，所制备的前药纳米粒不仅可以实现药物在肿瘤内被动靶向的富集，又因药物自身作为载体的主要部分而使得载药量非常高，通常高于50％，高载药量能减少载体材料的使用，减少甚至避免因载体材料的大量使用而导致的不良反应；此外，高载药量能有效提高药物的递送效率，在摄取相同数量纳米粒的条件下，高载药量的纳米粒将会“携带”更多的药物进入细胞，迅速达到有效治疗浓度，实现更高效的抗肿瘤作用；

4、在前药纳米粒中包载多种抗肿瘤药物，可以协同多种药物进行药物传递，同时发挥药物的药效，产生协同作用，增加药效，而且能够减少每种药物的用药剂量，降低不良反应，实现更高效的抗肿瘤作用。

附图说明

图1是实施例1制备的5-氟尿嘧啶-1-乙酸的¹HNMR和¹³CNMR图，其中图1A为¹HNMR图，图1B为¹³CNMR图；

图2是实施例5制备的C_18-oe-NH₂的¹HNMR图；

图3是实施例5制备的化合物C₁₈-oe-5fu的¹HNMR和¹³CNMR图，其中图3A为¹HNMR图，图3B为¹³CNMR图；

图4是实施例6制备的前药纳米粒NP的粒径及透射电镜观图，其中图4A为动态光散射粒径大小图，图4B为透射电镜图；

图5是实施例8中前药纳米粒NP在pH5.0和pH7.4缓冲液降解过程中的粒径变化图，其中5A为纳米粒的粒径图，图5B为光衍射强度变化图；

图6是实施例9中包载阿霉素的纳米粒NP/DOX在pH5.0和pH7.4缓冲液中的药物释放图，其中图6A为5FU药物释放图，图6B为DOX药物释放图；

图7是实施例10中A549、HepG2和H22细胞中包载阿霉素的纳米粒NP/DOX和裸药DOX的定性和定量摄取图，其中图7A、C和E为激光共聚焦显微镜图，图7B、D和F为流式细胞摄取图；

图8是实施例11中5FU和NP对A549、HepG2和H22细胞存活率的影响图，其中图8A-C为24h细胞存活率随浓度变化图，图8D-F为48h细胞存活率随浓度变化图；

图9是实施例12中A549(9A)、HepG2(9B)和H22(9C)细胞存活率随DOX、5FU/DOX和NP/DOX浓度变化图；

图10是实施例13中不同药物在小鼠体内抗肿瘤效果图，其中图10A为生理盐水组和5种药物组7天内小鼠肿瘤体积生长曲线，图10B为5种药物组7天内小鼠肿瘤体积生长曲线，图10C为生理盐水组和5种药物组7天内小鼠体重变化曲线，图10D为生理盐水组和5种药物组7天后小鼠肿瘤体积变化图，图10E为7天后小鼠肿瘤抑制率，图10F为生理盐水组和5种药物组7天后小鼠肿瘤照片。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

5-氟尿嘧啶-1-乙酸的制备:

称取10.07g 5-氟尿嘧啶(77.41mmol)置于250ml的圆底瓶中，之后加入13.03gKOH(0.23mol)，加入少量水，100℃反应半小时之后温度降到60℃，称取10.97g氯乙酸(0.12mol)，用少量水溶解，置于滴液漏斗中缓慢滴入原底瓶中，反应6小时，反应结束后，用盐酸调pH至5.0后4℃冷却4小时，用砂芯漏斗过滤，去除沉淀，用盐酸调pH至2.0，置于冰箱中冷却过夜，收集沉淀，用饱和的NaHCO3调节pH到5.0，冷却4小时，过滤，将滤液用盐酸调节pH至2.0，置于冰箱中，收集沉淀，置于真空干燥箱中干燥，得到白色固体产物14.3g，产率85.1％。通过¹H>13CNMR检测该白色固体，图谱如图1所示，其中图1A为¹H>13CNMR图。结果如下：¹H>2O):δ(ppm)4.52(S,2H,N-CH₂-CO),7.81(d,1H,C＝CH)；¹³CNMR(40MHz,D₂O,8):50.04，117.37，131.38，151.01，159.98，172.03。

实施例2

2,2,2-三氟-N-(2-甲氧基-[1,3]二戊烷-4-亚甲基)乙酰胺的制备：

(1)在氮气保护下，以250ml圆口反应瓶为反应容器，向其中加入15.49g(0.17mol)3-氨基-1，2-丙二醇，并用100ml乙腈溶解，冰浴，再缓慢滴加36.23g的三氟乙酸乙酯，室温揽拌反应12h，反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，然后加入300ml乙酸乙酯溶解旋蒸后的产物，用100ml10％的硫酸氨钟溶液和100ml饱和氯化钠溶液分别洗涂一次，收集有机相，用无水硫酸读干燥，过滤，滤液在真空下浓缩，即得到无色油状化合物2,2,2-三氟-N-(2,3-二羟基丙醇)乙酰胺26.53g，产率为83.4％；

(2)在氮气保护下，向250ml圆口反应瓶中加入21.35g 2,2,2-三氟-N-(3-二羟基丙醇)乙酰胺(0.11mol)和392.9mg对甲基苯磺酸(2.28mmol)，并用100ml乙腈溶解，再缓慢滴加48.43g原甲酸三甲酯(0.46mol)，室温揽拌反应12h，反应结束后，向反应液中加入3-4滴三乙胺(TEA)，旋转蒸法除去溶剂，然后加入300ml的乙酸乙酯溶解，旋蒸后的产物，用100ml饱和碳酸氢钠溶液和100ml饱和氯化钠溶液分别洗涤一次，收集有机相，用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液在真空下浓缩，即得到无色油状化合物2,2,2-三氟-N-(2-甲氧基-[1,3]二戊烷-4-亚甲基)乙酰胺19.35g，产率为74.02％。

实施例3

(1)2-八烷氧基-(1,3)二氧戊环-4-甲基胺(C_8-oe-NH₂)的制备：

取3.08g正辛醇(23.65mmol)、8.12g实施例2制备得到的2,2,2-三氟-N-(2-甲氧基-[1，3]二戊烷-4-亚甲基)乙酰胺(35.5mmol)和118.87mg吡啶对甲苯磺酸盐(0.47mmol)加入到100ml圆底反应瓶中，130℃真空油浴反应8h，冷却至室温，滴加几滴三乙胺终止反应，用少量的二氯甲烷溶解反应物，在加入几滴三乙胺的乙醇中沉降，置于-20℃冰箱中1h，用砂芯漏斗过滤，取上层沉淀，抽真空得到白色反应物7.34g，产率90.2％，将7.34g白色反应物置于圆底瓶中，用加了三乙胺的四氢呋喃溶解，取100ml的去离子水溶解7.67g NaOH(0.19mol)，冷却后加入四氢呋喃中搅拌过夜，旋蒸除去四氢呋喃，用二氯甲烷200ml萃取3次，干燥过夜，抽滤旋蒸抽油泵得到淡黄色固体(C_8-oe-NH₂)4.56g，产率86.2％。

(2)N-5-氟尿嘧啶1-乙基-2-八烷氧基-(1,3)二氧戊环-4-甲基酰胺(C₈-oe-5fu)的制备：

氮气保护下，取1.35g实施例1制备得到的5-氟尿嘧啶-1-乙酸(5.76mmol)、3.57g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC(18.62mmol)和2.15g N-羟基丁二酰亚胺NHS(18.62mmol)及溶剂无水二氯甲烷加入到100ml反应瓶中，氮气保护下，冰浴下反应6h，撤冰浴，然后滴入几滴三乙胺终止反应，获得羧基活化的5-氟尿嘧啶-1-乙酸；向其中加入0.93g上述制备得到的C_8-oe-NH₂(3.75mmol)，氮气保护下，25℃下反应48h，旋蒸，用截留分子量为500的透析袋透析2～3天，透析袋中的透析液为浓度2％的三乙胺水溶液，冷冻干燥得到目的化合物(C₈-oe-5fu)1.33g，产率84.7％。

实施例4

(1)2-十二烷氧基-(1,3)二氧戊环-4-甲基胺(C_12-oe-NH₂)的制备：

取3.84g正十二烷醇(20.61mmol)、7.08g实施例2制备得到的2,2,2-三氟-N-(2-甲氧基-[1，3]二戊烷-4-亚甲基)乙酰胺(30.91mmol)和103.58mg吡啶对甲苯磺酸盐(0.41mmol)加入到100ml圆底反应瓶中，130℃真空油浴反应8h，冷却至室温，滴加几滴三乙胺终止反应，用少量的二氯甲烷溶解反应物，在加入几滴三乙胺的乙醇中沉降，置于-20℃冰箱中1h，用砂芯漏斗过滤，取上层沉淀，抽真空得到白色反应物7.53g，产率91.3％，将7.53g白色反应物置于圆底瓶中，用加了三乙胺的四氢呋喃溶解，取100ml的去离子水溶解6.77g NaOH(0.17mol)，冷却后加入四氢呋喃中搅拌过夜，旋蒸除去四氢呋喃，用二氯甲烷200ml萃取3次，干燥过夜，抽滤旋蒸抽油泵得到淡黄色固体(C_12-oe-NH₂)4.76g,产率83.2％。

(2)N-5-氟尿嘧啶1-乙基-2-十二烷氧基-(1,3)二氧戊环-4-甲基酰胺(C₁₂-oe-5fu)的制备：

氮气保护下，取1.35g实施例1制备得到的5-氟尿嘧啶-1-乙酸(5.76mmol)、3.57gEDC(18.62mmol)和2.15g NHS(18.62mmol)及溶剂无水二氯甲烷加入到100ml反应瓶中，氮气保护下，冰浴下反应6h，撤冰浴，然后滴入几滴三乙胺终止反应，获得羧基活化的5-氟尿嘧啶-1-乙酸；向其中加入1.14g上述制备得到的C_12-oe-NH₂(3.73mmol)，氮气保护下，20℃下反应48h，旋蒸，用截留分子量为500的透析袋透析2～3天，透析袋中的透析液为pH8.0的0.01M磷酸缓冲溶液，冷冻干燥得到目的化合物物(C₁₂-oe-5fu)1.18g，产率86.13％。

实施例5

(1)2-十八烷氧基-(1,3)二氧戊环-4-甲基胺(C_18-oe-NH₂)的制备：

取5.12g 18醇(18.9mmol)、6.50g实施例2制备得到的2,2,2-三氟-N-(2-甲氧基-[1，3]二戊烷-4-亚甲基)乙酰胺(28.4mmol)和95.13mg吡啶对甲苯磺酸盐(0.37mmol)加入到100ml圆底反应瓶中，130℃真空油浴反应8h，冷却至室温，滴加几滴三乙胺终止反应，用少量的二氯甲烷溶解反应物，在加入几滴三乙胺的乙醇中沉降，置于-20℃冰箱中1h，用砂芯漏斗过滤，取上层沉淀，抽真空得到白色反应物8.04g，产率90.9％，将8.04g白色反应物置于圆底瓶中，用加了三乙胺的四氢呋喃溶解，取100ml的去离子水溶解6.19g NaOH(0.15mol)，冷却后加入四氢呋喃中搅拌过夜，旋蒸除去四氢呋喃，用二氯甲烷200ml萃取3次，干燥过夜，抽滤旋蒸抽油泵得到淡黄色固体(C_18-oe-NH₂)5.96g，产率93.3％。通过¹H>1H>2-CH₃),1.25(S,34H,CH₂-(CH₂)₈),3.47-3.74(m,2H,NH₂-CH₂),4.01-4.13(m,1H,CH-CH₂),4.26-4.32(m,1H,O-CH₂-CH),5.76(m,1H,CHO-CH₂)。

(2)N-5-氟尿嘧啶1-乙基-2-十八烷氧基-(1,3)二氧戊环-4-甲基酰胺(C₁₈-oe-5fu)的制备：

将氮气保护下，取1.35g实施例1制备得到的5-氟尿嘧啶-1-乙酸(5.76mmol)、3.57g EDC(18.62mmol)和2.15g NHS(18.62mmol)及溶剂无水二氯甲烷加入到100ml反应瓶中，氮气保护下，冰浴下反应6h，撤冰浴，然后滴入几滴三乙胺终止反应，获得羧基活化的5-氟尿嘧啶-1-乙酸；向其中加入1.38g上述制备得到的C_18-oe-NH₂(3.71mmol)，氮气保护下，30℃下反应48h，旋蒸，用截留分子量为500的透析袋透析2～3天，透析袋中的透析液为浓度0.1％的三乙胺水溶液，冷冻干燥得到目的化合物(C₁₈-oe-5fu)1.63g，产率81.09％。通过¹HNMR和¹³CNMR检测该化合物，图谱如图3所示，其中图3A为¹H>13CNMR图。结果如下：¹H>2-CH₃),1.24(S,34H,CH₂-(CH₂)₈),3.30-3.73(m,2H,NH₂-CH₂),4.05-4.22(m,1H,CH-CH₂),4.30-4.44(m,1H,O-CH₂-CH),4.55(s,2H,N-CH2-CO),5.80(m,1H,CHO-CH₂),7.50(s,1H,CF-CH)；¹³CNMR(400MHz,CDC13,8):14.09,22.72,26.09,29.07,29.35,31.76,42.38,50.76,64.74,73.40,74.38,113.00,115.33,154.36,161.04。

实施例6

5-氟尿嘧酸前药纳米粒的制备：

取40mg实施例5制备得到的化合物C₁₈-oe-5fu用1ml二氯甲烷溶解搅拌混匀，在涡旋的情况下将其滴加到2ml的5％PVA(pH8.0的PB缓冲液配)溶液中，立即超声3次，每次10s，间隔5s，功率300W；然后迅速加入到20ml的0.3％PVA溶液中(pH8.0的PB缓冲液配)，搅拌3h，使二氯甲烷挥发，12000rpm离心10min，离心3次，将沉淀用pH8.0的PB缓冲液分散获得悬液，从而获得C18-oe-fu纳米粒，命名为NP。

通过动态光散射粒度仪和透射电镜检测该纳米粒NP的粒径的分布及形貌，结果如下表1和图4所示，其中表1为纳米粒NP的表征，图4A为纳米粒NP的动态光散射粒径大小图，图4B为纳米粒NP的透射电镜图。

表1 C_18-oe-fu前药纳米粒NP的表征

粒径(nm)分散度光衍射强度(kcps)电位(mv)纳米粒NP178.00.100399.2-2.99

实施例7

包载阿霉素的5-氟尿嘧啶前药纳米粒的制备:

取20mg盐酸阿霉素加入到5ml EP管中，加入2ml去离子水，按摩尔比1:3加入三乙胺搅拌24h进行脱盐，冷冻干燥。

取30mg实施例5制备得到的C₁₈-oe-5fu用0.4ml二氯甲烷溶解后加入到6mg脱盐阿霉素中搅拌混匀，在涡旋的情况下将其滴加到2ml的5％PVA(pH8.0的PB缓冲液配)溶液中，随后立即超声3次，每次10s，间隔5s，功率300W；然后迅速加入到20ml的0.3％PVA溶液中(pH8.0的PB缓冲液配)，搅拌3h，使二氯甲烷挥发，12000rpm离心10min，离心3次，将沉淀用pH8.0的PB缓冲液分散获得悬液，从而制备出包载阿霉素的前药纳米粒，命名为NP/DOX。检测包包载阿霉素的C_18-oe-fu前药纳米粒NP/DOX的平均粒径、载药量、包封率以及电位，结果如下表2所示。

其载药量和包封率计算公式如下：

载药量(％)＝纳米粒中阿霉素的量/载药纳米粒的总量×100％

包封率(％)＝纳米粒中阿霉素的量/加入的总共阿霉素的量×100％

表2包载阿霉素的C_18-oe-fu前药纳米粒NP/DOX的表征

实施例8

纳米粒依赖pH降解的测定：

将实施例6制备的纳米粒NP干燥后分别分散到pH为5.0和7.4的磷酸缓冲溶液中，在预定的时间内通过DLS粒径仪测量其粒径变化，以此来评价其酸敏感性能，结果如图5所示，其中图5A为纳米粒在pH5.0和pH7.4缓冲液降解过程中的粒径，图5B为纳米粒在pH5.0和pH7.4缓冲液降解过程中的光衍射强度变化。从图5可以看出，纳米粒NP在pH7.4的条件下比较稳定，粒径和光衍射强度基本不变，而在pH5.0的条件下粒径随着时间的延长逐渐减小，光衍射强度逐渐减小，说明纳米粒在酸性条件下逐渐降解。

实施例9

5-氟尿嘧啶前药纳米粒NP和包载阿霉素5-氟尿嘧啶前药纳米粒NP/DOX的体外释放检测：

分别取1mL实施例6制备的纳米粒NP悬液和实施例7制备的包载阿霉素的纳米粒NP/DOX悬液置入截留分子量为3500的透析袋中，用棉线扎紧透析袋，放入到50mL的EP管中，再在EP管中加入10mL缓冲液，缓冲液为3组，pH分别为5.0、6.5和7.4，设3个重复，在37℃，120rpm条件下振荡，分别在设定的时间点取出缓冲液，并加入等量的新鲜缓冲液，然后测定其阿霉素浓度，计算阿霉素的释放量，5fu含量的测定通过最大紫外吸收峰来测定。释放测定方法，与上述相同。结果如图6所示，其中图6A为包载阿霉素的纳米粒NP/DOX在pH5.0和pH7.4缓冲液中的5FU药物释放，图6B为包载阿霉素的纳米粒NP/DOX在pH5.0和pH7.4缓冲液中的DOX药物释放。从图6可以看出，纳米粒NP在pH7.4的条件下5FU释放比较缓慢，120h药物释放率约为25％，而在pH5.0的条件下5FU释放比较快，在120h释放药物约为90％，载药纳米粒NP/DOX在pH7.4的条件下DOX释放比较缓慢，168h药物释放率约为20％，而在pH5.0的条件下DOX释放比较快，在168h释放药物约为90％。载药纳米粒在酸性条件下随着原酸酯键的降解，药物逐渐快速的释放。

实施例10

包载阿霉素5-氟尿嘧啶前药纳米粒NP/DOX的细胞定性和定量摄取检测：

将人肺腺癌细胞(A549)、人肝癌细胞(HepG2)和小鼠肝癌细胞(H22)以2.5×10⁵每孔的密度接种在6孔板内的盖玻片上，并在37℃含5％CO₂培养箱中全湿度培养24h。吸出培养液，分别加入200μl包载阿霉素5-氟尿嘧啶前药纳米粒(NP/DOX)和裸药阿霉素(freeDOX)并继续培养4h后，用PBS溶液冲洗盖玻片3次。DAPI染核10min并用PBS冲洗后再用甲醛固定30min。将制得的盖玻片在激光共聚焦显微镜下观察细胞的摄取情况，结果如图7A、7C、7E所示。图7A、7C、7E显示裸药DOX、载药纳米粒NP/DOX在A549、HepG2、H22三种细胞中细胞核和细胞质中都可以看出荧光信号，且NP/DOX在细胞核中比细胞质的荧光信号更强，说明NP/DOX能被细胞有效摄取并释出阿霉素进入细胞核。

将A549、HepG2和H22细胞的细胞消化液以每孔1×10⁵个接种于六孔板中贴壁生长24h。吸取培养基，用2ml的PBS洗两次，分别加入2ml包含NP/DOX和裸药DOX的新鲜培养基，且保持每孔阿霉素的最终浓度为8μg/ml。在37℃含5％CO₂培养箱中全湿度培养4h，吸去培养基，PBS洗两次后加少量胰酶消化，加入适量新鲜培养基终止消化，1000rpm离心10分钟，弃去上清培养基，用1ml的PBS分散后用流式细胞仪检测细胞的定量摄取情况，结果如图7B、7D、7F所示。流式细胞仪定量摄取图中可以看出细胞中阿霉素的信号按以下顺序递增：NP/DOX＜裸DOX，这与定性摄取结果相一致。

实施例11

5-氟尿嘧啶前药纳米粒NP的细胞毒性检测：

将A549、HepG2和H22细胞加入到96孔板中，保证每孔浓度在4000个左右，贴壁24h后，去除培养基，加入180μl的新鲜培养基，20μl的5-氟尿嘧啶(5FU)和5-氟尿嘧啶前药粒(NP)(浓度分别为1、5、10、50、100μg/mL)，共培养24h和48h后，然后去除培养基，加入180μl的新鲜培养基和20μl MTT(5mg/mL)共培养4h后，去除培养基，加入150μl的DMSO，震荡10min后，在570nm波长下检测，H22悬浮细胞补充处理如下：悬浮细胞省去消化步骤，直接计数稀释，后续操作相同。进行细胞存活率检测时，旧培养基不需移除，直接加入20μl MTT，检测时同样直接加入100μl三联甲瓒溶液，最后测定选用波长为570nm。结果如图8所示。其中图8A-C分别是不同浓度的裸5-氟尿嘧啶和5-氟尿嘧啶前药纳米粒NP在A549、HepG、H22细胞中作用24h的细胞毒性结果图。其中图8D-F分别是不同浓度的裸5-氟尿嘧啶和5-氟尿嘧啶前药纳米粒NP在A549、HepG、H22细胞中作用48h的细胞毒性结果图。从图中可以看出裸5-氟尿嘧啶和5-氟尿嘧啶前药纳米粒NP的细胞毒性呈现浓度和时间依赖性。随着时间的延长和浓度的增加，纳米粒不断释放药物，细胞毒性与裸药基本相同，甚至更好。

实施例12

包载阿霉素5-氟尿嘧啶前药纳米粒的细胞毒性检测

将A549、HepG2和H22细胞加入到96孔板中，保证每孔浓度在4000个左右，贴壁24h后，去除培养基，加入180μl的新鲜培养基，20μl的阿霉素(DOX)、5-氟尿嘧啶+阿霉素(5FU/DOX)、包载阿霉素5-氟尿嘧啶前药纳米粒(NP/DOX)(浓度分别为0.5、1、2、4、8、16、32μg/mL)，共培养24h后，然后去除培养基，加入180μl的新鲜培养基和20μl MTT(5mg/mL)共培养4h后，去除培养基，加入150μl的DMSO，震荡10min后，在570nm波长下检测，H22悬浮细胞补充处理如下：悬浮细胞省去消化步骤，直接计数稀释，后续操作相同。进行细胞存活率检测时，旧培养基不需移除，直接加入20μlMTT，检测时同样直接加入100μl三联甲瓒溶液，最后测定选用波长为570nm，结果如图9所示。从图9可以看出裸DOX，裸5FU/裸DOX，载阿霉素纳米粒NP/DOX的细胞毒性呈现浓度依赖性，且由于载药纳米粒NP/DOX在24h时药物释放比较缓慢，所以细胞毒性没有裸5FU/裸DOX的强，但随着浓度的增加，NP/DOX的细胞毒性效果逐渐与裸5FU/裸DOX趋于相同，甚至更好。

实施例13

小鼠体内抗肿瘤实验：

将冻存的鼠肝癌H22细胞复苏后，用0.2ml的培养基分散后保种于ICR小鼠腹腔内，待大约7天腹水生成后，用注射器抽出腹水，稀释10倍后，分别接种于小鼠左腋下，每只注入0.2ml，7天后选择肿瘤体积75mm³左右，体重为27g左右的小鼠为实验模型。

将建立的肿瘤模型小鼠随机分为8组，每组5只，当肿瘤体积达到75mm³，尾静脉注射，分别注射生理盐水(Saline)和5种药物，5种药物为5-氟尿嘧啶(5FU，药量为7mg/kg)、5-氟尿嘧啶前药纳米粒(NP，药量为7mg/kg)、裸药阿霉素(DOX，药量为5mg/kg)、5-氟尿嘧啶+自由阿霉素(5FU/DOX，阿霉素药量为5mg/kg，5-氟尿嘧啶药量为7mg/kg)和包载阿霉素的5-氟尿嘧啶前药纳米粒(NP/DOX，阿霉素药量为5mg/kg)。随后，每天用游标卡尺测量一次肿瘤的长径a和短径b，计算肿瘤体积(肿瘤体积＝b²×a/2)，生理盐水组和5种药物组7天内小鼠肿瘤体积变化曲线如图10A所示，5种药物组7天内小鼠肿瘤体积变化曲线如图10B所示；称量生理盐水组和5种药物组小鼠的体重，7天内小鼠体重变化曲线如图10C所示；7天后，处死小鼠，取出各组小鼠的肿瘤，称取各组肿瘤重量，小鼠肿瘤重量如图10D所示；肿瘤生长抑制率图10E所示；计算公式如下：

肿瘤生长抑制率＝(生理盐水组平均瘤重-药物组平均瘤重)/生理盐水组平均瘤重×100％

对7天后小鼠肿瘤进行拍照，照片如图10F所示。

从图10A看出生理盐水组小鼠肿瘤不断增大，7天后肿瘤体积大于570mm³，是起始瘤体积的6～7倍，然而对于各药物组肿瘤显著的被抑制生长(图10B)，且5FU、DOX、5FU/DOX的肿瘤呈现缓慢的肿瘤增长趋势，而NP、NP/DOX肿瘤大小呈现先减小后缓慢增加的趋势，且NP/DOX肿瘤增长更加缓慢，肿瘤体积更小。从图10C看出，在第二天5FU组、5FU/DOX组小鼠体重下降，这是由于5FU的毒副作用导致的，在第三天DOX组小鼠体重下降，这是由于DOX的毒副作用导致的，而NP、NP/DOX组小鼠并未出现这种现象，说明NP、NP/DOX可以降低药物的毒副作用。从图10D看出七天后肿瘤重量按大小排列：Saline>5FU>DOX>5FU/DOX>NP>NP/DOX，从图10E看出NP/DOX有显著的肿瘤抑制率。从图10F看出NP/DOX有显著的肿瘤抑制效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。