Der Oligosaccharyltransferase-Komplex aus Saccharomyces cerevisiae: Funktionelle Charakterisierung von Stt3 aus Hefe und seinen Homologen aus Campylobacter, Leishmania und Mensch

摘要

Protein N-Glykosylierung ist eine essentielle Proteinmodifikation, die von Hefe bis zum Menschen hoch konserviert ist. Hierbei wird zunächst das lipid-gebundene Oligosaccharid (LLO) der Zusam-mensetzung DolPP-GlcNAc2Man9Glc3 assembliert und nachfolgend von einem Membrankomplex, der Oligosaccharyltransferase (OST), auf Asparaginreste der Konsensussequenz Asn-X-Ser/Thr naszieren-der Polypeptidketten übertragen. Die OST der Bäckerhefe besteht aus neun Untereinheiten, wobei fünf Untereinheiten für das Wachstum der Zelle essentiell sind. Über die spezifische Funktion der einzel-nen Proteine ist bislang bekannt. ududZiel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung von Stt3. Sie ist eine der essentiellen Unter-einheiten der OST und ist mit mehr als 50 % das am höchsten konservierte Protein des Komplexes. Stt3 ist mit elf Transmembranspannen in der ER-Membran verankert und ragt mit seinem löslichen C-Terminus, vermutlich der katalytischen Domäne, ins Lumen des ER. ududDie hohe Konservierung erstreckt sich vor allem auf den luminalen Teil von Stt3, in welchem sog. DXD-/DDX-Motive zu finden sind. Wie aus Untersuchungen von Golgi-Glykosyltransferasen bekannt ist, befinden sich die Aspartatreste dieses Motivs im aktiven Zentrum und sind in die Katalyse invol-viert. Mit Hilfe ortsgerichteter Mutagenese wurden konservierte Aspartatreste der Stt3-Untereinheit aus Saccharomyces cerevisiae (S.c.Stt3) ausgetauscht und der Einfluß auf das Wachstum und die Gly-kosylierung untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass das in allen Stt3-Homologen vorkommen-de 516WWDYG520 Motiv sowie ein 582DDI584 für die OST-Funktion essentiell sind und mögliche Aspartatreste für die Katalyse darstellen.ududUntersuchungen von Stt3 aus dem Parasiten Leishmania major (L.m.Stt3) zeigten, dass es sich um ein funktionelles Homolog von S.c.Stt3 handelt. Es war in der Lage, das Stt3 der Hefe zu ersetzen, und be-wirkte in vivo eine fast vollständige Glykosylierung des Glykoproteins CPY. Messung der OST in vitro wie auch Untersuchungen in vivo in Hefemutanten mit Defekten in der LLO-Assemblierung er-gaben, dass das protozoische Homolog eine breite Substratspezifität besitzt und auch kürzere LLOs der Zusammensetzung DolPP-GlcNAc2Man5-9 mit hoher Effizienz überträgt. Anhand von Blue Native Analysen konnte gezeigt werden, dass L.m.Stt3 in zwei Formen in der ER-Membran vorliegt: In Anwesenheit von Stt3 der Hefe befindet sich L.m.Stt3 außerhalb des OST-Komplexes und überträgt nur unglukosylierte Oligosaccharide. Bei Repression von S.c.Stt3 hingegen wird nur ein Bruchteil des L.m.Stt3 in den Komplex rekrutiert und erlangt dort die Fähigkeit, DolPP-GlcNAc2Man9Glc3 zu trans-ferieren. ududDesweiteren wurde das Stt3-Homolog C.j.PglB aus dem Eubakterium Campylobacter jejuni unter-sucht, welches in dem sog. Pgl-Gencluster vorliegt, das alle Komponenten für N-Glykosylierung co-diert. Die Tatsache, dass in diesem Organismus außer Stt3 keine weiteren OST Homologe identifiziert werden können, unterstützt die postulierte katalytische Rolle von Stt3. Expressionsstudien von C.j.PglB in Hefe ergaben, dass C.j.PglB weder in vivo noch in vitro katalytische Aktivität besitzt. ududAuch die heterologe Expression des hoch konservierten Stt3-Homolog aus Homo sapiens (H.s.Stt3-A) in Hefe konnte das S.c.Stt3 nicht ersetzen.ududUm auszuschließen, dass Probleme beim Einbau der homologen Stt3-Proteine aus Campylobacter, Leishmania und Mensch in den OST-Komplex der Bäckerhefe entstehen und damit die Ursache für die negativen Befunde sind, wurden Fusionskonstrukte zwischen Hefe Stt3 und den anderen Homolo-gen hergestellt. Durch Austausch der Transmembranspannen und der C-terminalen, löslichen Domä-nen der Stt3-Proteine sollte eine mögliche, zu Inaktivität führende Konformationsänderung der Trans-membranspannen umgangen werden. Analysen in der Hefe ergaben jedoch, dass keines der Chimäre katalytische Aktivität zeigte. ududBlue Native Analysen von Fusionen zwischen H.s.Stt3-A und S.c.Stt3 ergaben Hinweise, dass das S.c.Stt3 zwischen der zweiten und siebten Transmembranspanne Determinanten enthält, die für den Einbau in den OST-Komplex notwendig sind. In Kombination mit in vivo Aktivitätsanalysen konnte gefolgert werden, dass der N-Terminus bis zur Mitte der zweiten Transmembranspanne zur Ausbil-dung einer katalytisch aktiven Stt3-Struktur benötigt wird. ududMittels eines biochemischen Ansatzes sollte ein OST-Minimalkomplex aus Einzelkomponenten in Li-pidvesikel rekonstituiert werden. Hierzu wurden neben S.c.Stt3 auch zwei weitere essentielle Untereinheiten, Ost1 und Wbp1, heterolog in E.coli oder zellfrei in einem in vitro Transkripitions- und Translationssystem exprimiert und erfolgreich in PE-Vesikeln integriert. Es zeigte sich jedoch, dass weder S.c.Stt3 allein noch in Kombination mit S.c.Ost1 und S.c.Wbp1 enzymatische Aktivität besitzt.