酿酒酵母Mek1与Hop1复合物及海环杆菌去乙酰化酶CmCBDA的结构与功能研究

摘要

论文的第一部分阐述了酿酒酵母减数分裂过程中，联会复合体的侧向元件Hop1与Mek1相互作用的结构与功能研究。减数分裂是一种特殊的细胞分裂方式，是有性生殖不可缺少的环节。减数分裂的正常进行对于维持物种染色体数目的稳定及产生多样性的后代十分重要。减数分裂前期Ⅰ过程中的同源重组是实现来自父本和母本基因信息交换的重要过程。同源重组的顺利进行需要联会复合体的参与以实现其一系列生物学行为的精确调控。联会复合体的结构组分Hop1通过其SCD结构域318位苏氨酸磷酸化与减数分裂特异性激酶Mek1 FHA结构域的相互作用来实现后者的定位与激活。激活的Mek1磷酸化一系列底物使得同源重组过程中修复模板的选择倾向于同源染色体的非姐妹染色单体，从而实现减数分裂的同源重组及后续行为的正常进行。认知Mek1-FHA如何识别Hop1 pT318对于深入理解Mek1的定位与激活十分重要。本文展示了酿酒酵母Mek1-FHA的单体及与Hop1 pT318小肽复合物的晶体结构。通过分析Mek1-FHA和PDB中已有的FHA结构域，我们提出一类位于结合口袋处的PSXS Motif。此类Motif在三维结构和底物识别模式上具有一定的保守性。通过分析复合物的结构，发现Hop1 pT318的+2氨基酸残基Phe320和+3氨基酸残基Va1321对于Mek1-FHA的选择性识别十分重要。以此为依据，我们鉴定了以往发现可能被Mek1-FHA识别的位点，结果显示pT+2和pT+3不含疏水性残基的位点均不能被Mek1-FHA识别。与此同时，在裂殖酵母中我们鉴定出Mek1-FHA能够识别Hop1 pT270，结合已报道的Mek1识别自身N端的pT15。上述结果暗示裂殖酵母Mek1能够通过两种方式实现自身的激活，这与酿酒酵母Mek1激活方式存在明显差异。本实验结果有助于更好的理解酿酒酵母和裂殖酵母减数分裂过程中Mek1和Hop1相互作用及功能的差异。 论文的第二部分初步探索了来源于海环杆菌（Cyclobacterium marinum）去乙酰化酶CmCBDA的结构生物学研究。骨关节炎是一种十分常见的老年性疾病，全球有数亿人受此疾病困扰。老年性骨关节炎的主要原因是软骨的退化。软骨退化的重要预防和治疗方式之一便是服用葡萄糖胺类产品，因此，葡萄糖胺类产品成为受全球市场青睐的保健品和处方药。然而，葡萄糖胺工业化生产工艺的缺陷使得葡萄糖胺类产品生产成本增高导致市场价格高昂而致使许多患者无力购买。目前，葡萄糖胺工业化生产的主要受限步骤是从前体乙酰葡萄糖胺去乙酰化生成葡萄糖胺的过程。CmCBDA属于Ydjc家族蛋白质，是目前唯一已知能在体外温和条件下选择性催化乙酰葡萄糖胺去乙酰化的酶。阐述CmCBDA对乙酰葡萄糖胺的特异选择性对于开发生产葡萄糖胺优质的生物催化剂具有重要意义。在本论文中，我们解析了CmCBDA与金属Mn离子和反应产物乙酸分子的复合物结构。实验结果显示CmCBDA在溶液中呈现二聚体的形态，与晶体的一个非对称单元包含两个CmCBDA分子一致。CmCBDA的整体结构呈现α-helix包裹β-sheet的形状，酶活的口袋位于β-sheet及其周边的loop区域。晶体结构的分析结果显示Asp22、His72和His143参与螯合Mn离子，而Asp21、His230和Arg253参与结合反应产物乙酸分子。与另外两个已经解析的Ydjc家族蛋白质进行结构比对，我们推测CmCBDA对于乙酰葡萄糖胺的选择性可能与其结合口袋的相对狭窄封闭有关。本实验初步探索了CmCBDA的结构生物学研究及其对乙酰葡萄糖胺的选择性，为进一步完整阐述CmCBDA的催化机制、底物选择性及后续的酶工程改造奠定了基础。

目录

声明

摘要

第1章酿酒酵母Mek1与Hop1相互作用的结构与功能研究

1．1．1引言

1．1．2减数分裂前期I的染色体行为

1．1．3同源染色体间的配对、联会和重组

1．1．4联会复合体

1．1．5线性元件

1．1．6联会复合体侧向元件Hop1的组装与功能

1．1．7减数分裂特异性激酶Mek1

1．1．8 FHA结构域的结构特点

1．1．9 FHA结构域的底物识别特点

1．1．10 FHA结构域介导的非磷酸化依赖性的相互作用

1．1．11总结

1．2实验材料与方法

1．2．2目的基因片段回收

1．2．3目的基因片段的双酶切实验

1．2．4质粒的改造提取及线性化

1．2．5重组质粒的构建

1．2．6感受态细胞的制备

1．2．7连接产物转化至感受态细胞

1．2．8单克隆的鉴定与测序

1．2．9突变体的构建

1．2．10 Mek1 FHA结构域的表达

1．2．11 6×His标签融合蛋白质的纯化

1．2．12 GST标签蛋白质的亲和纯化

1．2．13重组蛋白质的TEV酶切

1．2．14蛋白质的精细纯化-AKTA系统分子筛

1．2．15蛋白质的精细纯化-AKTA系统离子交换

1．2．16 SDS-PAGE蛋白质电泳

1．2．17等温滴定量热实验

1．2．18蛋白质晶体的生长、数据收集及结构解析

1．2．19蛋白质的圆二色光谱

1．3实验结果

1．3．1酿酒酵母和裂殖酵母Mek1 FHA结构域的重组表达

1．3．2体外鉴定酿酒酵母Mek1-FHA对Hop1 pThr318的优先选择性

1．3．3酿酒酵母Mek1-FHA单体及与Hop1 pThr318复合物晶体结构

1．3．4酿酒酵母Mek1-FHA与Hop1 pThr318的相互作用细节

1．3．5 Mek1-FHA对Hop1 pThr318的pT+2和pT+3的特异性相互作用

1．3．6 Mek1-FHA的结构特点及其PSXS Motif

1．3．7酿酒酵母Mek1-FHA结合底物的鉴定

1．3．8裂殖酵母Mek1-FHA的结合底物鉴定

1．4讨论

1．4．3酿酒酵母和裂殖酵母的Mek1激酶活性的调控机制

1．5课题总结与展望

1．5．2酿酒酵母Mek1激酶激活机制的研究

1．5．3裂殖酵母Mek1 pThr15和Hop1 pThr270功能探索

第2章海环杆菌去乙酰化酶CmCBDA的结构与功能研究

2．1背景介绍

2．1．1骨关节炎的特点及其预防与治疗

2．1．2葡萄糖胺在骨关节炎预防与治疗中的作用

2．1．3葡萄糖胺的需求与生产工艺探索

2．1．4葡萄糖胺的工业化生产流程

2．1．5 CmCBDA的鉴定和酶活特点

2．1．6 Ydjc家族的研究进展

2．1．7总结

2．2实验材料与方法

2．2．1目的基因的合成与优化

2．2．2 CmCBDA的克隆表达与纯化

2．2．3晶体的初步筛选

2．2．4衍射数据的收集和处理

2．3实验结果与讨论

2．3．1 CmCBDA的全长表达

2．3．2 CmCBDA的晶体结构描述

2．3．3酶活口袋的细节描述

2．3．4 Ydjc家族成员的序列比对结果

2．3．5 CmCBDA的同源性搜索

2．3．6 CmCBDA对乙酰葡萄糖胺选择性识别的初步阐述

2．4总结与展望

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的学术论文与参加的学术会议