Die essentielle Bedeutung des 'Classical Transient Receptor Potential 6' (TRPC6)-Ionenkanals für die akute vaskuläre Hypoxiereaktion der Lunge : Untersuchungen an isolierten pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen

摘要

Die Hypoxische Pulmonale Vasokonstriktion (HPV) ist eine physiologische Antwort der Lunge auf alveoläre Hypoxie, bei der die Perfusion des Blutes zur Optimierung des Gasaustausches an die Ventilation angepasst wird. Dieser erstmals 1946 durch von Euler und Liljestrand postulierte Regulationsmechanismus ist hinsichtlich Sauerstoffsensor- und Signaltransduktionsweg noch nicht umfassend geklärt. Untersuchungen an isolierten pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen (PASMC) zeigen einen Hypoxie-induzierten Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i) und eine darauf folgendeKontraktion. Dies weist auf eine Funktion der PASMC sowohl als Sensor- als auch als Effektorzelle für die HPV hin. Darüberhinaus wird aber auch eine Rolle des Endothels durch Freisetzung von vasokonstriktiv wirkenden Substanzen wie Endothelin-1 (ET-1) imZusammenhang mit der HPV diskutiert. Dabei scheint die akute Phase der HPV (Dauer:Sekunden bis Minuten) endothelunabhängig und die protrahierte Phase der HPV (Dauer:Stunden) endothelabhängig zu sein.Zur Untersuchung der HPV auf der Ebene der PASMC wurde in der vorliegenden Arbeiteine geeignete Zellisolierungs- und Meßmethodik für PASMC der Ratte etabliert. Die Zellen wurden dabei insbesondere aus dem präkapillären Bereich derintrapulmonalarteriellen Gefäße gewonnen. Bei der Charakterisierung der kultivierten Zellen mittels der Immunofluoreszenzmethode zeigte sich für die Passagen P0, P1 und P3 eine positive Färbung für die für glatte Muskelzellen typischen Proteine alpha-Aktin und die schweren Ketten des Myosins. Endothelzellen konnten durch eine fehlende Färbung gegen den von Willebrand Faktor ausgeschlossen werden. Untersuchungen mittels des Western-Blots zeigten keinen Unterschied bezüglich der Menge des alpha-Aktins und der schweren Ketten des Myosins bei einem Vergleich zwischen P1 und P3, was auf einen Erhalt des kontraktilen Zustands im Zuge der Kultivierung der PASMC hinwies. Als geeigneteMessmethodik für die Untersuchung der Hypoxieantwort stellte sich die Messung der intrazellulären Ca2+-Konzentration [Ca2+]i mittels Fura-2 heraus. Ein Vergleich der Reaktion der PASMC von P0, P1 und P3 auf ET-1 als positiven Stimulus ergab eine Abnahme des transienten Anstiegs der [Ca2+]i mit zunehmender Passage. Deshalb wurden alle darauffolgenden Experimente mit nicht-passagierten PASMC (= Passage 0) durchgeführt. Zur Schaffung der hypoxischen Bedingungen für die Untersuchung der Hypoxieantwort der PASMC wurde ein Perfusionssystem etabliert.In einem zweiten Schritt erfolgte die Übertragung der Zellisolierung und der [Ca2+]i-Messtechnik von Ratten auf Maus PASMC, da dies auch die Untersuchung von PASMC aus gendefizienten Mäusen ermöglichte. Da frühere Untersuchungen auf eine wichtige Rolle der Rezeptor-aktivierbaren, nicht-selektiven klassischen „transient receptor potential“ TRPC-Kanäle für die Regulation des Tonus glatter Muskelzellen hinweisen und TRPC6 eine essentielle Komponente der Rezeptor-operierten Ca2+-durchlässigen nichtselektiven Kationenkanäle in den glatten Muskelzellen ist, wurde die Bedeutung der TRPC6-Kanäle für die Hypoxieantwort untersucht. Dabei zeigte sich, dass PASMC von Wildtyp (WT)-Mäusen, aber nicht von TRPC6-/--Mäusen unter Hypoxie mit einem Anstiegder [Ca2+]i reagierten. Alle Messungen erfolgten nach Sensibilisierung der PASMC mit ET-1. Dieser Anstieg der [Ca2+]i wurde im Wesentlichen durch den Einstrom von Ca2+-Ionen aus dem Extrazellulärraum durch spannungsabhängige L-Typ Ca2+-Kanäle (VOCC) bewirkt, da die Inhibition derselben mittels Nicardipin einen Anstieg der [Ca2+]i verhinderte.Im Gegensatz zu den VOCC sind TRPC6-Kanäle auch für andere Kationen als Ca2+durchlässig. Untersuchungen mittels der Mn2+-Quench-Methode zeigten für PASMC der WT-Mäuse einen größeren Hypoxie-induzierten Mn2+-Einstrom als für PASMC derTRPC6-/--Mäuse, das auf einen Hypoxie-induzierten Kationen-Einstrom durch TRPC6-Kanäle hinweist. Aus früheren Untersuchungen ist bekannt, dass in Anwesenheit von extrazellulären Na+-Ionen der Kationeneinwärtsstrom durch TRPC6-Kanäle hauptsächlich durch Na+-Ionen und nur zu einem geringen Prozentsatz (ca. 4%) durch Ca2+-Ionen verursacht wird. Dies führt zu der Hypothese, dass die durch den Na+-Ioneneinstrom verursachte Membrandepolarisierung möglicherweise unter Inhibition von spannungsabhängigen Kalium (KV)-Kanälen einen Ca2+-Einstrom durch VOCC bewirkt. Da sowohl die Anreicherung von Diacylglycerol (DAG) durch Inhibition der DAG-Kinase mittels des DAG-Kinase Inhibitors R59949 als auch t-BHP (tertiäres Butyl-Wasserstoffperoxid) einen Anstieg der [Ca2+]i nur in WT, aber nicht in TRPC6-/--PASMC unter Hypoxie bewirkte, und im Rahmen der HPV besonders ROS (Reaktive Sauerstoffspezies) wie O2-. und H2O2 als Mediatoren diskutiert werden, scheint die TRPC6-Aktivierung unter Hypoxie durch eine ROS-vermittelte DAG-Akkumulation verursacht zu werden. Um dies genauer aufschlüsseln zu können, wäre einerseits die Messung der zellulären DAG-Konzentration und andererseits die Ermittlung der genauenRolle von ROS unter Hypoxie ein wichtiges Ziel für weitere Untersuchungen.