Antikörper-vermittelte Kopplung magnetischer Nanopartikel an Endothel- und Tumorzellen : eine in vitro Studie zur magnetischen Wärmebehandlung

摘要

Tumorerkrankungen spielen im heutigen Klinikalltag eine immer größere Rolle. Zur Behandlung von bösartigen Erkrankungen werden neben chirurgischen Verfahren, Chemotherapie und Bestrahlung eingesetzt. Der Bedarf an Optimierung der Therapieerfolge und das große Spektrum von Nebenwirkungen dieser Therapieverfahren verdeutlichen den Forschungsbedarf in Hinblick auf alternative Methoden. Ein potentiell alternatives Verfahren ist die magnetische Wärmebehandlung. Ziel dieser Methode ist es kleinste Eisenoxidpartikel in Form von magnetischen Nanopartikeln im Tumorgewebe anzureichern und mit einem externen Magnetwechselfeld eine lokalisierte Erwärmung der Region zu erzeugen. Durch einen Temperaturanstieg auf über 50°C kann das Gewebe irreversibel geschädigt werden. Durch die bisher durchgeführte intratumorale Applikationsform sind multifokale Karzinome oder unzugängliche Tumore ungenügend erreichbar. Aus diesem Grund ist eine selektive Anreicherung von magnetischem Material und eine einfache Darreichungsform z.B. als intravenöse Applikation notwendig. Einen interessanten Ansatz bietet hierfür die selektive Anreicherung von magnetischem Material über spezifisch an eine Zielstruktur bindende Antikörper. Hierbei ist eine intravasale Applikation mit Anschwemmung zum Zielgewebe über das Gefäßsystem vorstellbar. Als Zielstrukturen können bekannte Rezeptoren, die auf der Zelloberfläche von Tumorzellen überexpremiert werden, Verwendung finden. Des Weiteren bietet die gesteigerte Expression definierter Rezeptoren auf Zellen von Tumorgefäßen verglichen mit gesunden Endothelzellen einen Ansatzpunkt. So ist eine antikörpervermittelte Kopplung von magnetischem Material an Tumorgefäß bzw. Tumorzellen vorstellbar. Die anschließende Erwärmung im magnetischen Wechselfeld kann hierbei eine Schädigung dieser Zellen induzieren. Zur Untersuchung dieses Ansatzes wurden in der in vitro Situation Endothelzellen und Tumorzellen über eine antikörpervermittelte Kopplung mit magnetischen Nanopartikeln über verschiedene Bindungsmodelle beladen. Um das Potential und die Mechanismen der spezifischen Bindung beurteilen zu können, wurden Vergleichsuntersuchungen zur unspezifischen Bindung von Nanopartikeln an Makrophagen durchgeführt. Hierbei konnte eine zeitabhängige Steigerung der Partikelaufnahme beobachtet werden (2h Inkubation 12,5 pg/Zelle; 12h Inkubation 73,5 pg/Zelle). Eine Abhängigkeit der im magnetischen Wechselfeld (MWF) erzielten Temperaturerhöhung der magnetisch markierten Zellen von derBehandlungszeit wurde ebenfalls ermittelt (12h, DT=15,31K). Die Untersuchungen der antikörpervermittelten Kopplung magnetischer Nanopartikeln an Zellen wurden mit der sogenannten Mehrschrittmethode bzw. Einschrittmethode durchgeführt. Beim Einsatz der Mehrschrittmethode wurden den Endothelzellen im ersten Schritt Antikörper, im zweiten Schritt magnetische Nanopartikel zugegeben. Bindungsvermittler waren hierbei die Brückenmoleküle Biotin und Streptavidin. Zur Analyse der Einflüsse von Inkubationszeiten und Temperaturen auf die zellulären Prozesse der rezeptorvermittelten Partikelaufnahme erfolgte die Variation der Behandlungsbedingungen. Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten unter verschiedenen Behandlungsbedingungen(Inkubation Antikörper von 30 min bis 90 min) eine stetige Abnahme der Eisenoxidmenge in den Zellen mit zunehmender Nanopartikelinkubationsdauer (bis 90 min). Diese Abnahmetendenzen sind vermutlich auf Endozytose- und Exozytoseprozesse der Zellen zurückzuführen. Die zellgebundene Menge an Nanopartikeln war hierbei zu gering um eine Temperaturerhöhung im MWF zu erzeugen. Die Verwendung der Einschrittmethode ermöglichte die Gabe der Antikörper und Nanopartikel als sogenannte Sonden in einem Schritt zu den Zellen. Es wurden hierbei drei Sondenmodelle untersucht. Zum einen wurde eine Sondenkopplung über die bereits beschriebenen Brückenmoleküle erreicht. Die Behandlung der Endothelzellen mit dieser Sonde zeigte mit zunehmender Inkubationszeit (bis 90 min) eine Abnahmetendenz der Eisenoxidmengen. Voraussichtlich sind hierfür Exozytoseprozesse der Zellen verantwortlich. Zwei weitere Sonden wurden über chemische Bindung hergestellt. Hierbei wurden Antikörper gegen Endothelzell- bzw. Tumorzellrezeptoren an Nanopartikel gekoppelt und die Zellen für 30 min mit diesen Sonden behandelt. Eine spezifische Bindung der Sonden an Endothel- und Tumorzellen konnte erreicht werden. Wobei die hohe Beladung der Tumorzellen mit magnetischem Material (1,242 pg/Zelle) bei der Messung im MWF zu einer Temperaturerhöhung von 5 K führte. In den Untersuchungen konnte eine spezifische Markierung von Zellen mit magnetischen Nanopartikeln erreicht werden. Die Steigerung der Zellmarkierung ist jedoch erforderlich. Hierzu müssen zelluläre Einflüsse (Endozytose und Exozytose) auf die Partikelaufnahme aufgeklärt und die Weiterentwicklung von Sonden vorangebracht werden.