Comparacao de diferentes protocolos para a deteccao do vírus da diarreia virai bovina por RT-PCR em grupos de sangue total e de soro sanguíneo, artificialmente contaminados

摘要

A técnica da RT-PCR foi otimizada e avaliada para a deteccao da regiao 5' terminal nao-traduzida do genoma do vírus da diarreia virai bovina (B VDV) em amostras clínicas de bovinos, constituídas por soro sanguíneo e sangue total, artificialmentecontaminadas com a estirpe NADL do BVDV. Para a otimizacao da técnica foram avaliados: i) dois pares de primers, 103 / 372 (WEINSTOCK et al., 2001) e 324 / 326 (VILCEK et al., 1994) ii) quatro métodos de extracao do ácido nucléico (fenol / clorofórmio / álcool isoamílico; sílica / isotiocianato de guanidina; uma combinacao dos dois métodos anteriores e TRIzol~(TM)) e iii) diferentes concentracoes e composicoes de reagentes, tampoes e tempo/temperatura das reacoes. Entre todas as alternativas testadas a que resultou na amplificacao de um produto com 290 pb, que foi facilmente visualizado em gel de agarose 2% com brometo de etídeo, foi a que empregou as seguintes condicoes: i) primers 103 e 372; ii) volume inicial e amostra clínica: 50 mL de soro sanguíneo; iii) extracao do ácido nucléico: método da sílica / isotiocianato de guanidina, iv) transcricao reversa: 9 mL do ácido nucléico extraído, 1xPCR buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,4 e 50 mM KC1), 1,5 mM MgCl_2, 60 unidades da enzima transcriptase reversa M-MLV, desnaturacao do RNA a 97°C / 4 min e transcricao reversa a 42°C / 30 min e v) PCR: primers 103 / 372 com temperatura de anelamento de 59°C. A utilizacao da RT-PCR nas condicoes otimizadas nesse estudo possibilitou a amplificacaoda estirpe NADL do BVDV (10 TCID_(50)) empoais, artificialmente contaminados, de soro sanguíneo de bovinos até a diluicao de l: 160.