Polymerase chain reaction（PCR）の応用：In situ PCR法

摘要

細胞内に発現しているDNA/RNAを可視的に検出する手法としてin situ hybIidization法が開発され、普及してきている。 In situ hybridization法は、はじめに放射性リンで標識したcDNAプローブを用いる手法（hot法）が開発された。 しかしこの古典的手法は、DNAブローブを用いるために検出の特異性が低く、放射性リンで標識するために細胞レベルで高い局在性を保ちながら高感度に検出することが困難であった。 Digoxigenin（DIG）で核酸を標識する手法（cold法）が、Roche Diagnostics社（Rotkreuz、SwitzerIand; Boehringer Mannheim社が開発してきたものだが、最近Roche社に統合された）を中心に開発され、これを用いてcRNAプローブを標識することで特異性高く、かつ局在性を保ちながら非常に高感度に検出できるようになってきている。しかしながら、高感度なDIG法を用いても、数コピーのレベルの極僅かしか発現していない核酸をin situ hybridization法で検出することはできない。そこで、あらかじめ標的とするDNA（RNAを検出しようとする場合は、あらかじめ逆転写してcDNAにしておかなくてはならない）をpolymerase chain reaction（PCR）法で数百万倍にまで増やしておき、その後in situ hybridization法で検出するin situ PCR法が開発された。 In situ PCR法で組織切片に含まれる標的DNA/RNAを可視化しようとする場合、0.1 pg/10,000 mu m~2（厚さ3 mu mの切片の場合）が検出限界であると考えられている。In situ PCR法は、検出しようとする標的核酸の増幅法の違いから、大きく2種類の手法に分かられる。