ЭФФЕКТИВНАЯ СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОИ УРАЦИЛ-ДНК-ГЛИКОЗИЛАЗЫ Esherichia coli ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ПЦР-ДИАГНОСТИКЕ

摘要

Разработана эффективная схема получения рекомбинантной урацил-ДНК-гликозилазы Escherichia coli штамм К12, предназначенной для использования в ПЦР-диагностике, которая позволила добиться высокого выхода целевого продукта при использованием двух стадий его очистки. Ген, кодирующийэтот фермент, клонирован в вектор pCWori в одной рамке считывания с шестью остатками гистидина в С-концевой последовательности. С использованием данного вектора и Е. coli штамм DH5a создана экспрессионная система "хозяин-вектор" и оптимизированы условия синтеза белка. Для очистки белка использовали металло-аффинную хроматографию с последующим диализом для удаления имидазола. Выход фермента составлял не менее 60 мг целевого белка на 1 л культуральной среды. Соответствие аминокислотной последовательности рекомбинантного и нативного ферментов подтверждено методами "пептидного фингерпринта" и масс-спектрометрического анализа. Предложен экспресс-метод определения активности ферментного препарата. Установлено, что активность 1.0 мг рекомбинантного белка составляла не менее 3 х 10~3 ед. Рекомбинантный фермент проявлял наибольшую стабильность при рН 8.0 и ионной силе раствора, равной 200 м М, и полностью терял активность за 10 мин при 60°С. Хранение в течение 1 г при -20°С приводило к потере не более 30% активности. В ферментном препарате отсутствовала активность ДНКазы. Свободная энергия разворачивания белковой глобулы рекомбинантной урацил-ДНК-гликозилазы равна 23.1 ± 0.2 кДж/моль. Полученные данные свидетельствуют о том, что рекомбинантный фермент можно рекомендовать к использованию в П ЦР-диагностике для предотвращения появления ложных положительных результатов, обусловленных загрязнением реакционной смеси продуктами предшествующих реакций.