In s/tu immunofluorescence localization: A method for rapid detection of Beauveria spp. in the rhizosphere of Quercus robur saplings

摘要

Zur biologischen Bekämpfung von Pflanzenschädlingen, z.B. Maikäfer-Engerlingen, in der Rhizosphäre von Eichen, Apfelbäumen oder Kiefern werden zunehmend entomo-pathogene Beauveria-Spezies eingesetzt. Für eine erfolgreiche Anwendung ist es wichtig, die Ausbreitung und Persistenz der ausgebrachten Pilze qualitativ und quantitativ zu erfassen. Die Bestimmung beider Größen durch Ausplattieren auf selektiven Nährmedien oder durch molekulare Methoden wie PCR ist mühsam und oft ungenügend. Ziel der vorliegenden Studie war daher, eine spezifische In-situ-Methode durch Immunfluoreszenzmarkierung von Beauveria spp. zu entwickeln, hier an jungen Feinwurzeln dreijähriger Stieleichen. Durch Anfärben mit dem unspezifischen Farbstoff Blankophor wurde sichtbar, dass alle untersuchten Feinwurzeln ein dichtes Netz von Bodenpilzen trugen. Polyklonale Beau-veria-Antikörper markierten an nicht beimpften Wurzeln keinen dieser natürlich wachsenden Pilze. Mit Beauveria brongniartii beimpfte Wurzeln zeigten bis zu zehn Monate nach der Inokulation eine spezifische Markierung. Während die natürlich vorkommenden Rhizosphären-Pilze in den Interzellularräumen der Wurzelrinde wuchsen, waren Hyphen von inokulierter B. brongniartii nie im Wurzelgewebe zu finden, sondern nur oberflächlich auf der Rhizodermis. Diese Beobachtungen zeigen, dass B. brongniartii bei Eichenwurzeln nicht endophytisch wächst, und dass die verwendete Methode die Unterscheidung von B. brongniartii von der in der Eichen-Rhi-zosphäre lebenden Pilzflora ermöglicht. Immunfluoreszenzmarkierung, wie in der aktuellen Studie eingesetzt, kann eine nützliche Methode sein, um ß. brongniartii in der Rhizosphäre nachzuweisen und quantitativ zu erfassen und somit eine Langzeitkontrolle von Schädlingen mit Entomopathogenen zu ermöglichen.%For biological control of plant pests, e.g. cockchafer grubs, in the rhizosphere of oak, apple or pine trees, ento-mopathogenic Beauveria spp. are increasingly applied. For successful use, it is important to monitor the spread and persistence of the inoculated fungi, both qualitatively and quantitatively. The determination of both parameters by plating on selective nutrient media or by molecular methods such as PCR of soil samples are quite laborious and often do not yield satisfactory results. Therefore, the aim of the present study was to develop a specific in situ method using immunofluorescence labelling of Beauveria spp. growing on young fine roots of three-year old oak saplings. All fine roots investigated were covered with a dense net of soil rhizosphere fungi, as visualized by staining with the nonspecific dye blanko-phor. On non-inoculated roots, polyclonal Beauveria antibodies did not label any of these naturally growing fungi. Only samples of roots inoculated with Beauveria brongni-artii displayed specific labelling up to ten months after inoculation. Whereas the natural rhizosphere fungi were detected growing in the intercellular space of the root cortex in an ectomycorrhiza-like manner up to the endo-dermis, hyphae of the inoculated B. brongniartii were never seen within the root tissue but only growing on the surface of the rhizodermis. These observations indicate that B. brongniartii does not grow endophytically, and that the method used allows to discriminate B. brongniar-tii from the resident fungal flora in the oak tree rhizosphere. Detection by immunofluorescence labelling employed in the current study may be a useful tool to follow B. brongniartii in experiments aimed at establishing the entomopathogen in the rhizosphere and to monitor its fate in long-term control of entomopathogens.