Construction, characterization, and preliminary BAC-end sequencing analysis of a bacterial artificial chromosome library of white clover (Trifolium repens L.)

摘要

White clover (Trifolium repens L.) is a forage legume widely used in combination with grass in pastures because of its ability to fix nitrogen. We have constructed a bacterial artificial chromosome (BAC) library of an advanced breeding line of white clover. The library contains 37248 clones with an average insert size of approximately 85 kb, representing an approximate 3-fold coverage of the white clover genome based on an estimated genome size of 960 Mb. The BAC library was pooled and screened by polymerase chain reaction (PCR) amplification using both white clover microsatellites and PCR-based markers derived from Medicago truncatula, resulting in an average of 6 hits per marker; this supports the estimated 3-fold genome coverage in this allotetraploid species. PCR-based screening of 766 clones with a multiplex set of chloroplast primers showed that only 0.5% of BAC clones contained chloroplast-derived inserts. The library was further evaluated by sequencing both ends of 724 of the clover BACs. These were analysed with respect to their sequence content and their homology to the contents of a range of plant gene, expressed sequence tag, and repeat element databases. Forty-three microsatellites were discovered in the BAC-end sequences (BESs) and investigated as potential genetic markers in white clover. The BESs were also compared with the partially sequenced genome of the model legume M. truncatula with the specific intention of identifying putative comparative-tile BACs, which represent potential regions of microsynteny between the 2 species; 14 such BACs were discovered. The results suggest that a large-scale BAC-end sequencing strategy has the potential to anchor a significant proportion of the genome of white clover onto the gene-space sequence of M. truncatula.Le trèfle blanc (Trifolium repens L.) est une légumineuse fourragère largement cultivée en combinaison avec des graminées en raison de sa capacité à fixer l'azote. Les auteurs ont produit une banque de clones dans des chromosomes bactériens artificiels (BAC) à partir d'une lignée de sélectionneur du trèfle blanc. La banque compte 37 248 clones dont la taille moyenne est d'environ 85 kb, ce qui correspond à environ trois génomes du trèfle blanc sur la base d'un génome estimé à 960 Mb. La banque de BAC a été groupée en pools et criblée par amplification PCR à l'aide de microsatellites du trèfle blanc et de marqueurs PCR provenant du Medicago truncatula. En moyenne, six clones ont été obtenus pour chaque marqueur, ce qui est conforme à une couverture équivalent à trois génomes chez cette espèce allotétraploïde. Le criblage par PCR de 766 clones à l'aide d'un multiplexe d'amorces chloroplastiques a révélé que seulement 0,5 % des clones contenaient des inserts dérivés de l'ADN chloroplastique. La banque a été caractérisée plus en détail en séquençant les 2 extrémités de 724 clones BAC. Ces séquences ont été analysées pour ce qui est de leur composition et de leur homologie avec les séquences déposées dans une banque de données comprenant divers gènes, EST et séquences répétées de plantes. Quarante-trois microsatellites ont été décelés parmi les extrémités séquencées (BES) et examinés en tant que marqueurs génétiques potentiels chez le trèfle blanc. Les BES ont également été comparés avec le génome partiellement séquencé de la légumineuse modèle Medicago truncatula dans le but spécifique d'identifier de potentiels BAC représentant des régions de microsynténie entre les deux espèces et 14 de ces BAC ont été identifiés. Les résultats suggèrent qu'une approche de séquençage à grande échelle des extrémités de BAC rendrait possible l'ancrage d'une portion significative du génome du trèfle blanc à l'espace génique du M. truncatula.