两株羊巴贝斯虫细菌人工染色体(BAC)文库的构建

摘要

本研究团队于2010年启动了应用Solexa方法测定羊莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株的全基因组序列测定工作.然而由于数据的不完整性,获得的数据并不能完全组装成出基因组精确图谱.所本研究拟建立这两种巴贝斯虫的BAC文库,为构建其物理图谱和基因组精确图谱做前期的铺垫工作.通过体外培养羊巴贝斯虫未定种新疆株和莫氏巴贝斯虫临潭株单克隆虫株,并感染除脾绵羊,当染虫率达到15％后,收集血液,去除白细胞,用渗透压方法裂解红细胞,差速离心纯化巴贝斯虫裂殖子.将纯化的虫体包埋于低熔点琼脂糖,用蛋白酶K进行消化处理,得到巴贝斯虫基因组DNA.将包埋于低熔点琼脂糖中的巴贝斯虫基因组DNA用限制酶Hind Ⅲ进行梯度酶切,选取最佳酶量进行大规模不完全酶切.脉冲场凝胶电泳分离回收大小在50kb～200kb的基因组片段,将其与Epicentre公司的CopyControl pCC1BAC Cloning-readyvector进行连接,连接产物转化到高效E.coli Transformax EPI300感受态细胞,成功构建了两株巴贝斯虫细菌人工染色体文库.结果表明,羊巴贝斯虫未定种新疆株和莫氏巴贝斯虫临潭株的文库分别挑取了19,200和34,560个克隆,随机挑取100个克隆进行NotⅠ酶切鉴定,表明克隆的平均插入片段大小分别是65kb和70kb,对二者的基因组覆盖率分别是168倍和134倍.两个文库的空载率均低于3％,分别随机挑取6个克隆进行稳定性继代实验,比较指纹图谱表明克隆能够稳定存在.两株巴贝斯虫BAC文库的构建,为进一步绘制二者的精细物理图谱、比较二者在基因组水平上的差异奠定了基础.