Expression and bioactivity of recombinant segments of human perforin

摘要

The aim of the study was to prepare an active recombinant human perforin by comparing 5 candidate segments of human perforin. Full-length perforin, MAC1 (28-349 aa), MAC2 (166-369 aa), C-100, and N-60 of human perforin were selected as candidate active segments and designated, respectively, HP1, HP2, HP3, HP4, and HP5. The target genes were amplified by PCR and the products were individually subcloned into pGEM-T. The genes for HP1, HP2, HP3, and HP5 were subcloned into pET-DsbA, whereas pET-41a (+) was used as the expression vector of HP4. The fusion proteins were expressed in Escherichia coli BL21pLysS(DE3) and purified using nickel nitrilotriacetic acid (NTA) agarose affinity chromatography. The hemolysis microassay was used as an activity assay of fusion protein. From this study, we obtained the recombinant plasmids pGEM-T-HP1, -HP2, -HP3, -HP4 and -HP5, consisting of 1600, 960, 600, 300bp, and 180, respectively. From these recombinant plasmids, expression plasmids were successfully constructed and expressed in E. coli BL21pLysS(DE3). The resultant fusion proteins, affinity purified using Ni-NTA, were ~80, 58, 45, 44, and 30 kDa, respectively. The recombinant proteins were assayed for activity on hemolysis. HP2 and HP5 were the only recombinant proteins that were active in hemolysis, and the hemolytic function was concentration dependent. These results demonstrate that active recombinant forms of perforin can be synthesized in a prokaryote model. The recombinant N-60 and MAC1 (28-349 aa) of human perforin have the function of forming pores. Our study provides the experimental basis for further investigation on the application of perforin.Le but de cette étude était de préparer une perforine recombinante active, en comparant 5 segments candidats de la perforine humaine. La perforine humaine pleine longueur, et les fragments MAC1 (28-349 aa), MAC2 (166-369 aa), C-100 et N-100 de la perforine ont été choisis comme segments candidats actifs et appelés HP1, HP2, HP3, HP4, et HP5. Les gènes cibles ont été amplifiés par PCR et les produits ont été sous-clonés individuellement dans le vecteur pGEM-T. HP1, HP2, HP3, et HP5 ont été sous-clonés dans le vecteur pET-DsbA, alors que pET-41a était utilisé comme vecteur d'expression de HP-4. Les protéines de fusion ont été exprimées chez Escherichia coli BL21pLysS(DE3) et purifiées par chromatographie d'affinité sur Ni-NTA agarose. Des micro-essais d'hémolyse ont été utilisés pour tester l'activité des protéines de fusion. Nous avons obtenu les plasmides recombinants pGEM-T-HP1, -HP2, -HP3, -HP4, et -HP5, comportant respectivement 1600, 960, 600, 300, et 180 pb. À partir de ces plasmides recombinants, des plasmides d'expression ont été construits avec succès et exprimés chez E. coli BL2pLysS(DE3). Les protéines de fusion résultantes, purifiées par affinité sur Ni-NTA avaient environ 80, 58, 45, 44 et 30 kDa respectivement. L'activité hémolytique des protéines recombinantes a été testée. HP2 et HP5 étaient les seules protéines recombinantes qui étaient actives dans l'hémolyse, la fonction hémolytique étant dépendante de la concentration. Ces résultats démontrent que des formes recombinantes actives de la perforines peuvent être synthétisées dans un modèle procaryote. Les perforines recombinantes humaines N-60 et MAC1 (28-349 aa) exercent des fonctions lors de la formation du pore. Nos études proposent des bases expérimentales pour des recherches éventuelles sur l'application de la perforine.