Cloning and characterization of an alternative splicing transcript of the gene coding for human cytidine deaminase

摘要

Human cytidine deaminase (HCD) catalyzes the deamination of cytidine or deoxycytidine to uridine or deoxyuridine, respectively. The genomic sequence of HCD is formed by 31kb with 4 exons and several alternative splicing signals, but an alternative form of HCD has yet to be reported. Here we describe the cloning and characterization of a small form of HCD, HSCD, and it is likely to be a product of alternative splicing of HCD. The alignment of DNA sequences shows that the HSCD matches HCD in 2 parts, except for a deletion of 170 bp. Based on the HCD genome organization, exons 1 and 4 should be joined and all sequences of introns and exons 2 and 3 should be deleted by splicing. This alternative splicing shifted the translation of the reading frame from the point of splicing. The estimated molecular mass is 9.8kDa, and this value was confirmed by Western blot and mass spectroscopy after expressing the gene fused with glutathionine-S-transferase in the pGEX vector. The deletion and shift of the reading frame caused a loss of HCD activity, which was confirmed by enzyme assay and also with NIH3T3 cells modified to express HSCD and challenged against cytosine arabinoside. In this work we describe the identification and characterization of HSCD, which is the product of alternative splicing of the HCD gene.La cytidine désaminase humaine (CDH) catalyse la désamination de la cytidine ou de la désoxy-cytidine en uridine ou en désoxy-uridine respectivement. La séquence génomique de la CDH s'étend sur 31 kb et comprend 4 exons et plusieurs signaux d'épissage alternatif, mais aucune forme alternative de CDH n'a été rapportée jusqu'à maintenant. Nous décrivons ici le clonage et la caractérisation d'une forme courte de CDH, la CDHC, qui est probablement le produit de l'épissage alternatif de la CDH. L'alignement de séquences d'ADN montre que la CDHC correspond à 2 parties de la CDH, à l'exception d'une délétion de 170 pb. Sur la base de l'organisation génomique de la CDH, les exons 1 et 4 devrait être joints et toutes les séquences des introns et des exons 2 et 4 devraient être enlevées par l'épissage. Cet épissage alternatif a décalé la traduction du cadre de lecture à partir du point d'épissage. Le poids moléculaire estimé est de 9.8 kDa et cette valeur a été confirmée par buvardage et spectroscopie de masse, après avoir exprimé le gène fusionné avec la glutathionine-S-transferase dans un vecteur pGEX. La délétion et le décalage du cadre de lecture a causé la perte de l'activité CDH, ce qui a été confirmé par un essai enzymatique, ainsi que dans des cellules NIH3T3 modifiées exprimant la CDHC et traitées à la cytosine arabinoside. Dans ce travail, nous décrivons l'identification et la caractérisation de CDHC, qui est un produit de l'épissage alternatif du gène CDH.