急性髓性白血病预后相关基因的分析与验证

摘要

目的 寻找与急性髓性白血病(AML)预后相关基因,并在细胞系中验证.方法 调取癌症基因组图谱(TCGA)数据库中患者基因表达与生存信息,并通过单因素Cox回归、随机森林排序、多因素Cox回归得到预后相关基因.采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)在2013年4月至2017年6月对宁波市北仑区人民医院30例AML患者和2015年5月至2017年12月宁波大学医学院生物样本库10例健康志愿者的骨髓单个核细胞中进行验证,并在GSE12417数据集中进一步验证.在确定候选基因HECTD3后,以HECTD3-scramble为对照,设计HECTD3-shRNA敲低载体,包装为慢病毒.将AML-193细胞系分为HECTD3-scramble、HECTD3-shRNA组,使用流式细胞仪检测感染效率,qPCR与Western blot检测mRNA与蛋白水平的敲低效率.采用CCK-8法检测细胞增殖,Annexin V APC/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡,PI染色法检测细胞周期.采用Western blot检测泛素结合蛋白的变化,以及NF-κB通路p65、IKBα磷酸化的变化.同时提取HECTD3-scramble、HECTD3-shRNA核蛋白,使用凝胶迁移实验检测NF-κB转录活性的变化.结果 使用Cox回归模型最终确定15个AML预后相关基因,15个预后相关基因在训练与测试数据集中均表现良好,在AML患者骨髓单个核细胞中,相对于健康志愿者骨髓单个核细胞,15个基因中的HECTD3表达水平最高,HECTD3表达水平在GSE12417数据集中同样与患者总体生存率相关.HECTD3-shRNA对于AML-193细胞具有很好的感染效率,且HECTD3-scramble与HECTD3-shRNA中HECTD3在mRNA表达水平分别为1.00±0.12、0.23±0.07,蛋白水平也有相似的改变.在细胞增殖中HECTD3-scramble与HECTD3-shRNA 72 h时增殖指数分别为5.41±0.21、3.34±0.18,在细胞凋亡中,HECTD3-scramble组与HECTD3-shRNA组ANNEXIN V+(％)比例分别为4.21±1.38、28.64±5.89,在细胞周期中,HECTD3-scramble组与HECTD3-shRNA组G1期细胞比例(％)分别为30.56±5.61、51.61±6.12,差异均有统计学意义(均P<0.001).HECTD3-shRNA组与HECTD3-scramble组相比,泛素结合蛋白比例显著下降,且NF-κB通路中p65、IKBα磷酸化降低,总IKBα升高.HECTD3-shRNA同时使得NF-κB转录活性显著下降.结论 使用多基因联合的Cox回归模型能够较好地预测AML患者的预后,其中HECTD3基因能够影响AML细胞的生物学功能,且该作用与NF-κB通路的改变相关.