黄芪甲苷干预的EPC-Exos对高糖诱导损伤间充质干细胞向内皮分化的影响

摘要

目的探讨黄芪甲苷(AstragalosideⅣ,AS-Ⅳ)干预的人内皮祖细胞外泌体(Endothelial progenitor cells derived exosomes,EPC-Exos)对高糖诱导损伤人脐血间充质干细胞(Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,hUCBMSCs)向内皮分化的影响。方法体外分离和培养人内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs),同时体外分离和培养hUCBMSCs,取P4代细胞分别进行成骨、成软骨和成脂诱导分化鉴定。将鉴定成功的EPCs分别用100mg·L-1的黄芪甲苷和等量的PBS干预,培养24 h后收集两组细胞上清液中外泌体。采用透射电子显微镜观察EPC-Exos的形态,利用纳米粒子追踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)技术检测EPC-Exos的粒径,Western blot技术进行外泌体特征性标志物CD9、CD63和TSG101的检测。将hUCBMSCs用30 mmol·L-1的葡萄糖预处理120h后,随机分为实验组和对照组,同时设置正常组。三组细胞培养24 h后,通过Matrigel体外成管实验研究EPC-Exos对hUCBMSCs成管分化的影响。免疫荧光检测hUCBMSCs表达CD31、vWF等内皮细胞特异标志物的情况。结果光镜下hUCBMSCs边缘清楚,形态均一,排列呈漩涡状,3系细胞分化为典型图像。透射电镜观察分离及提纯后黄芪甲苷干预EPC-Exos为包膜完整的圆形或椭圆形微囊泡结构;NTA技术检测97.6%人EPC-Exos为直径在81.4-142.1nm之间的微囊泡;EPC-Exos表面特异标志物CD9、CD63、TSG101呈阳性,以上实验证实成功提取EPC-Exos。Matrigel成管实验显示,与对照组相比,实验组MSCs细胞体外成管能力显著增强,差异显著(P<0.001)。免疫荧光检测显示,与对照组相比,实验组MSCs表达内皮细胞特异性标志物CD31、vWF能力显著增强,差异显著(P均<0.01)。结论黄芪甲苷干预的EPC-Exos可有效恢复高糖受损人间充质干细胞的成管功能且显著改善其向内皮分化能力。